構成性アンドロステイン受容体（CAR）のアゴニスティックリガンドの同定のためのエピトープタグ付きタンパク質を用いた新しい細胞ベースのレポーターアッセイシステム

Novel cell-based reporter assay system using epitope-tagged protein for the identification of agonistic ligands of constitutive androstane receptor (CAR).

• Jun Imai
• Yasushi Yamazoe
• Kouichi Yoshinari

抄録

構成性アンドロステイン受容体（CAR）は、外来生物やエネルギー代謝を含む複数の肝機能、さらには肝がん化にも重要な役割を果たしている。CARは種に依存したリガンド選択性を示しており、異種生物の作用には種差があります。このように、興味のある化合物がヒトのCARを活性化するか否かを知ることは、化学物質の安全性評価に役立つ。しかし、CAR はリガンドが存在しない状態では基底転写活性が高いため、細胞を用いたアッセイでは明確なリガンド反応を観察することは非常に困難である。本研究では、HepG2 細胞の C 末端にエピトープタグを融合させた CAR を用いたレポーターアッセイでは、対応するアゴニストに対しては基底活性は低く、高い反応性を示すが、間接活性化剤であるフェノバルビタールに対しては反応しないことを見出した。このシステムを用いて、176種の工業用化学物質がヒトおよびマウスのCARを活性化する能力についてスクリーニングされ、6種の化合物がヒトおよび/またはマウスのCARを中等度または強力に活性化した。これらの化合物によって誘導された CAR 介在性転写は、ヒトおよびマウスの CAR インバースアゴニストであるクロトリマゾールおよびアンドロスタノールによってそれぞれ阻害され、新たに同定された CAR 活性化剤は CAR のアゴニスティックリガンドであることが示唆された。以上のことから、我々のレポーターアッセイシステムは、化学物質のCARに対するアゴニスティック活性を評価するための有望なツールとなる可能性がある。

Constitutive androstane receptor (CAR) plays vital roles in multiple liver functions including xenobiotic and energy metabolisms, and also in hepatocarcinogenesis. CAR shows species-dependent ligand selectivity, leading to species differences in the actions of xenobiotics. Thus, to know whether a compound of interest activates human CAR or not is helpful for the chemical safety evaluation. However, it is very difficult to observe clear ligand response for CAR in cell-based assays, because of its high basal transcriptional activity in the absence of its ligands. In this study, we found that reporter assays using HepG2 cells human and mouse CAR fused with an epitope-tag at its C-terminus showed low basal activity and high response to the corresponding agonists but not to their indirect activator, phenobarbital. Using this system, 176 industrial chemicals were screened for their abilities to activate human and mouse CAR, and 6 compounds moderately or strongly activated human and/or mouse CAR. The CAR-mediated transcriptions induced by these compounds were blocked by clotrimazole or androstanol, the human and mouse CAR inverse agonists, respectively, suggesting that the newly identified CAR activators are agonistic ligands of CAR. Taken together, our reporter assay system may be a promising tool to assess chemicals' agonistic activities toward CAR.