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Rac1とRhoAの活性化は角膜内皮バリア機能を維持する
Activation of Rac1 and RhoA Preserve Corneal Endothelial Barrier Function.
PMID: 27849309 DOI: 10.1167/iovs.16-20031.
抄録
目的:
角膜内皮は角膜ストロマの正しい水分補給を担っています。角膜内皮細胞は増殖能力が低いため、角膜病理、加齢、凍結保存、移植など、浸透圧の不均衡を引き起こす最適な条件下でバリア機能を維持することは、角膜の透明性を維持するために不可欠である。我々は、ヒト角膜内皮細胞およびマウス角膜において、角膜内皮バリアを可逆的に破壊する高浸透圧ショックによって誘導されるシグナル伝達を調べた。
Purpose: The corneal endothelium is responsible for the correct hydration of the corneal stroma. Corneal endothelial cells have a low proliferative capacity, so preserving their barrier function under suboptimal conditions that cause osmotic imbalance, such as those arising from corneal pathologies, age, cryopreservation, and transplantation, is essential for maintaining corneal transparency. We have investigated the signaling induced by hyperosmotic shock that reversibly disrupts corneal endothelial barriers in human endothelial cells and in murine corneas.
方法:
内皮バリア特性は、ヒト内皮細胞株B4G12-HCECの電気細胞基質インピーダンスセンシング（ECIS）と共焦点顕微鏡によってin vitroで解析し、ex vivoでは、共焦点顕微鏡とマウス角膜の刺激放出消去（STED）超解像顕微鏡によって解析した。B4G12-HCECにおいて、塩化ナトリウムの過剰摂取により誘導される過浸透圧ストレスに対する細胞シグナル伝達を調べた。Rho GTPase活性は、RhoエフェクターのRho結合ドメインに融合した組換えGSTタンパク質を用いたプルダウンアッセイによって検出された。
Methods: Endothelial barrier properties were analyzed in vitro by electric cell substrate impedance sensing (ECIS) and confocal microscopy of the human endothelial cell line B4G12-HCEC, and, ex vivo, by confocal microscopy and stimulated emission-depletion (STED) super-resolution microscopy of murine corneas. Cell signaling in response to hyperosmotic stress, induced with an excess of sodium chloride, was investigated in B4G12-HCECs. Rho GTPase activity was detected by pulldown assays with recombinant GST proteins fused to the Rho binding domains of Rho effectors.
結果:
高浸透圧ストレスはアクチン重合を増加させ、Rho GTPases Rac1とRhoAを活性化したが、Cdc42は活性化しなかった。Rac1とRhoAを介した経路の阻害は、バリア破壊にはわずかな影響を与えたが、ストレスからの離脱後のバリア再形成を部分的に遅らせた。対照的に、Rac1とRhoAの活性化は、構成的な内皮バリア機能を増強し、バリア修復を促進した。
Results: Hyperosmotic stress increased actin polymerization and activated the Rho GTPases Rac1 and RhoA, but not Cdc42. Rac1- and RhoA-mediated pathway inhibition had a minor effect on barrier disruption but partially delayed barrier reformation after stress withdrawal. In contrast, Rac1 and RhoA activation enhanced constitutive endothelial barrier function and accelerated barrier repair.
結論:
我々の結果は、Rac1とRhoAの活性化はストレスによる細胞収縮を媒介するのではなく、バリアの恒常性を回復し維持するために作用する内皮応答であることを示している。したがって、これら2つのGTPaseを薬理学的に活性化することは、角膜内皮バリア機能を維持するための治療戦略となる可能性がある。
Conclusions: Our results indicate that Rac1 and RhoA activation do not mediate stress-induced cell contraction but are endothelial responses that act to restore and maintain barrier homeostasis. Therefore, pharmacological activation of these two GTPases could be a therapeutic strategy for preserving corneal endothelial barrier function.