リアルタイム・マルチプレックスPCRによる環境DNAからの複数種の同時検出：日本産メダカ2種への応用

Real-time multiplex PCR for simultaneous detection of multiple species from environmental DNA: an application on two Japanese medaka species.

抄録

種の分布に関する情報は、生態学的研究にとって極めて重要である。近年、水生生物の分布を推定するために、環境DNA（eDNA）分析が用いられている。eDNA分析には，メタバーコーディングや種特異的PCRなどのいくつかの分析法が用いられている。しかし，対象とする生物種が少数である場合，非対象種のDNAの増幅によるリードの無駄な消費のため，メタバーコーディングは費用対効果が低い。一方、種特異的PCR法では、テストを何度も繰り返す必要があり、DNAテンプレートや実験用消耗品の消費量が多くなる。ここでは、リアルタイム・マルチプレックスPCRを用いて、数種の生物を同時に検出するための方法論を提案する。我々は，2種のメダカ（Oryzias latipesとo. sakaizumii）の種特異的なプライマー・プローブセットを開発し，リアルタイム・マルチプレックスPCRに使用した。水族館での実験では，種の存在量に偏りがあっても，すべてのサンプルで両種が同時に検出された。フィールド調査では，eDNA解析と捕獲調査により，魚類密度の低い場所を含むすべてのサンプリングサイトで一貫した結果が得られた。リアルタイムマルチプレックスPCRを用いたeDNA解析は，他の水生生物にも容易に適用できるため，複数の対象生物の分布調査をより費用対効果の高い方法で行うことができる。

Information about species distribution is crucial to ecological studies. Environmental DNA (eDNA) analysis has recently been used to estimate the distribution of aquatic organisms. Several analytical methods including metabarcoding and species-specific PCR are being used for eDNA analysis. However, when only a few species are targeted, metabarcoding is not cost-effective because of the wasted consumption of read due to amplification of non-target species DNA. On the other hand, species-specific PCR requires tests to be repeated multiple times resulting in consuming more DNA templates, and experimental consumables. Here we propose a methodological framework for simultaneously detecting a few species using real-time multiplex PCR. We developed the species-specific primer-probe sets for two species of Japanese medaka (Oryzias latipes and o. sakaizumii), and we used them in the real-time multiplex PCR. In aquarium experiment, even when the species abundances were biased, both species were simultaneously detected in all samples. In a field survey, eDNA analysis and capture survey produced consistent results in all sampling sites, including sites with low fish densities. eDNA analysis using real-time multiplex PCR can be easily applied to other aquatic organisms, enabling a more cost-effective distribution survey of multiple target organisms.