Stag2の欠損はEWS-FLI1と協力してマウス間葉系幹細胞を形質転換する

Loss of Stag2 cooperates with EWS-FLI1 to transform murine Mesenchymal stem cells.

• Marc El Beaino
• Jiayong Liu
• Amanda R Wasylishen
• Rasoul Pourebrahim
• Agata Migut
• Bryan J Bessellieu
• Ke Huang
• Patrick P Lin

抄録

背景:

ユーイング肉腫は、間葉系由来の原始細胞の悪性腫瘍である。EWS-FLI1以外の遺伝的な摂動がこの腫瘍の発生に協力している可能性が高い。ヒトでは約15％の症例でSTAG2の変異が確認されている。本研究では、STAG2の欠損がEWS-FLI1と協力して、マウス間葉系幹細胞（MSC）由来の肉腫を発生させているのではないかという仮説を立てた。

BACKGROUND: Ewing sarcoma is a malignancy of primitive cells, possibly of mesenchymal origin. It is probable that genetic perturbations other than EWS-FLI1 cooperate with it to produce the tumor. Sequencing studies identified STAG2 mutations in approximately 15% of cases in humans. In the present study, we hypothesize that loss of Stag2 cooperates with EWS-FLI1 in generating sarcomas derived from murine mesenchymal stem cells (MSCs).

方法:

誘導性EWS-FLI1トランスジーンを有するマウスを、純粋なC57/Bl6バックグラウンドのp53マウスと交配させた。MSCはマウスの骨髄由来のものを用いた。EWS-FLI1誘導およびStag2ノックダウンは、それぞれアデノウイルス-CreおよびshRNAを担持したpGIPZレンチウイルス感染によってin vitroで達成された。その後、細胞を10Gyの電離放射線で処理した。軟寒天アッセイにより、インビトロでのアンカレッジ独立増殖を評価した。細胞の遊走および浸潤は、トランスウェルアッセイによって評価した。細胞は、腫瘍形成を試験するために、C57/Bl6マウスにMatrigelを筋肉内注射した。

METHODS: Mice bearing an inducible EWS-FLI1 transgene were crossed to p53 mice in pure C57/Bl6 background. MSCs were derived from the bone marrow of the mice. EWS-FLI1 induction and Stag2 knockdown were achieved in vitro by adenovirus-Cre and shRNA-bearing pGIPZ lentiviral infection, respectively. The cells were then treated with ionizing radiation to 10 Gy. Anchorage independent growth in vitro was assessed by soft agar assays. Cellular migration and invasion were evaluated by transwell assays. Cells were injected with Matrigel intramuscularly into C57/Bl6 mice to test for tumor formation.

結果:

遺伝子型EWS-FLI1 p53を持つ初代マウスMSCは形質転換に抵抗性があり、照射しなくてもシンジニーマウスでは腫瘍を形成しなかった。Stag2阻害は、照射したEWS-FLI1 p53のMSCにおいて肉腫形成の効率と速度を有意に増加させた。腫瘍形成の効率は、Stag2阻害を受けた細胞を注射したマウスでは91％、Stag2阻害を受けていない細胞を受けたマウスでは22％であった（p<.001）。Stag2ノックダウンは、Kaplan-Meier解析でマウスの生存率を低下させた(p<.001)。また、Stag2はin vitroではMSCの遊走と浸潤を増加させたが、増殖率や異数性化には影響を与えなかった。

RESULTS: Primary murine MSCs with the genotype EWS-FLI1 p53 were resistant to transformation and did not form tumors in syngeneic mice without irradiation. Stag2 inhibition increased the efficiency and speed of sarcoma formation significantly in irradiated EWS-FLI1 p53 MSCs. The efficiency of tumor formation was 91% for cells in mice injected with Stag2-repressed cells and 22% for mice receiving cells without Stag2 inhibition (p < .001). Stag2 knockdown reduced survival of mice in Kaplan-Meier analysis (p < .001). It also increased MSC migration and invasion in vitro but did not affect proliferation rate or aneuploidy.

結論:

Stag2の欠損はEWS-FLI1との相乗効果により、マウスMSCからの肉腫の産生に影響を与えるが、そのメカニズムは増殖の増加や染色体の不安定性とは関係がないかもしれない。初代マウスMSCは形質転換に抵抗性であり、p53ヌル変異、EWS-FLI1、Stag2阻害の組み合わせでは、MSCを直ちに肉腫に転換させることはできない。このモデルでは照射が必要であることから、MSCからEWS-FLI1が駆動する肉腫の発生にはStag2とp53以外の他の遺伝子の摂動が必須である可能性が示唆される。

CONCLUSION: Loss of Stag2 has a synergistic effect with EWS-FLI1 in the production of sarcomas from murine MSCs, but the mechanism may not relate to increased proliferation or chromosomal instability. Primary murine MSCs are resistant to transformation, and the combination of p53 null mutation, EWS-FLI1, and Stag2 inhibition does not confer immediate conversion of MSCs to sarcomas. Irradiation is necessary in this model, suggesting that perturbations of other genes beside Stag2 and p53 are likely to be essential in the development of EWS-FLI1-driven sarcomas from MSCs.