SV40 T抗原とssDNAおよび複製タンパク質Aとの相互作用：遅延鎖DNA複製におけるT抗原モノマーの制御的役割

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Nucleic Acids Res..2020 04;48(7):3657-3677. 5780084. doi: 10.1093/nar/gkaa138.

SV40 T抗原とssDNAおよび複製タンパク質Aとの相互作用：遅延鎖DNA複製におけるT抗原モノマーの制御的役割

SV40 T antigen interactions with ssDNA and replication protein A: a regulatory role of T antigen monomers in lagging strand DNA replication.

Nichodemus O Onwubiko
Angela Borst
Suraya A Diaz
Katharina Passkowski
Felicia Scheffel
Ingrid Tessmer
Heinz P Nasheuer

PMID: 32128579 PMCID: PMC7144908. DOI: 10.1093/nar/gkaa138.

抄録

DNA複製はすべての生物の中心的なプロセスです。ポリオマウイルスのDNA複製は真核生物のDNA複製のモデル系として機能し、基本的な複製機構の理解に大きく貢献してきました。しかし、その詳細はまだ不明であり、特に遅延鎖合成に関しては不明な点が多いのが現状です。我々は、様々な細胞内タンパク質が同時にまたは連続してDNAに結合して複製を開始する複雑な機構を明らかにするために、SV40大型T抗原（Tag）を用いて一本鎖DNA（ssDNA）相互作用を調べた。原子間力顕微鏡(AFM)による一分子イメージングと生化学的・分光学的解析を組み合わせることで、単量体およびオリゴマーのTagがssDNAに高親和性で結合していることを明らかにした。ssDNAの長さに応じて、TagとssDNAの相互作用の解離定数（KD値は10-30nM）が得られ、それはヒト複製タンパク質A（RPA）によるssDNA結合と同じオーダーの大きさである。さらに、RPA-Tag-ssDNA複合体の形成を観察したところ、RPA-Tag-ssDNA複合体には、単量体のTagだけでなく、六量体のTagも含まれていることがわかった。さらに、RPA-Tag-ssDNA複合体を形成していることを明らかにした。重要なことは、単量体のTagが岡崎断片合成におけるプライマーゼ機能を刺激するのに対し、六量体のTagはこの反応を阻害し、DNA複製の開始を遅鎖上で再定義することを明らかにした。

DNA replication is a central process in all living organisms. Polyomavirus DNA replication serves as a model system for eukaryotic DNA replication and has considerably contributed to our understanding of basic replication mechanisms. However, the details of the involved processes are still unclear, in particular regarding lagging strand synthesis. To delineate the complex mechanism of coordination of various cellular proteins binding simultaneously or consecutively to DNA to initiate replication, we investigated single-stranded DNA (ssDNA) interactions by the SV40 large T antigen (Tag). Using single molecule imaging by atomic force microscopy (AFM) combined with biochemical and spectroscopic analyses we reveal independent activity of monomeric and oligomeric Tag in high affinity binding to ssDNA. Depending on ssDNA length, we obtain dissociation constants for Tag-ssDNA interactions (KD values of 10-30 nM) that are in the same order of magnitude as ssDNA binding by human replication protein A (RPA). Furthermore, we observe the formation of RPA-Tag-ssDNA complexes containing hexameric as well as monomeric Tag forms. Importantly, our data clearly show stimulation of primase function in lagging strand Okazaki fragment synthesis by monomeric Tag whereas hexameric Tag inhibits the reaction, redefining DNA replication initiation on the lagging strand.