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合成ゲノミクスプラットフォームを用いたSARS-CoV-2の迅速な再構築
Rapid reconstruction of SARS-CoV-2 using a synthetic genomics platform.
PMID: 32365353 DOI: 10.1038/s41586-020-2294-9.
抄録
逆遺伝学は、ウイルスの病態解明やワクチン開発に欠かせないツールとなっている。コロナウイルスなどの大型RNAウイルスのゲノムは、その大きさと不安定性のため、大腸菌でのクローニングや操作が煩雑である。そのため、RNAウイルスのリバースジェネティクスのための代替的な迅速かつ堅牢なプラットフォームは、研究コミュニティの利益になるだろう。ここでは、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ニューモウイルス科のメンバーを含む多様なRNAウイルスを遺伝的に再構築するための酵母ベースの合成ゲノミクスプラットフォームの完全な機能を示しています。ウイルスサブゲノム断片は、ウイルス単離物、クローニングされたウイルスDNA、臨床サンプルまたは合成DNAを用いて生成され、これらの断片は、次に、酵母人工染色体としてゲノムを維持するために、形質転換に関連した組換えクローニングを用いて、サッカロミセス・セレビシエにおいて一段階で再構築された。次いで、T7 RNAポリメラーゼを用いて感染性RNAを生成し、生存可能なウイルスを救出した。このプラットフォームを用いて、我々は、最近のコロナウイルスのパンデミック（COVID-19）を引き起こした重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）のウイルスの化学的に合成されたクローンを、合成DNA断片を受け取ってからわずか1週間で工学的に生成することができた。我々がここで説明する技術的進歩は、それが発生中に進化したRNAウイルスバリアントのリアルタイム生成と機能的特性評価を可能にするので、新興のウイルスへの迅速な対応を容易にする。
Reverse genetics has been an indispensable tool to gain insights into viral pathogenesis and vaccine development. The genomes of large RNA viruses, such as those from coronaviruses, are cumbersome to clone and manipulate in Escherichia coli owing to the size and occasional instability of the genome. Therefore, an alternative rapid and robust reverse-genetics platform for RNA viruses would benefit the research community. Here we show the full functionality of a yeast-based synthetic genomics platform to genetically reconstruct diverse RNA viruses, including members of the Coronaviridae, Flaviviridae and Pneumoviridae families. Viral subgenomic fragments were generated using viral isolates, cloned viral DNA, clinical samples or synthetic DNA, and these fragments were then reassembled in one step in Saccharomyces cerevisiae using transformation-associated recombination cloning to maintain the genome as a yeast artificial chromosome. T7 RNA polymerase was then used to generate infectious RNA to rescue viable virus. Using this platform, we were able to engineer and generate chemically synthesized clones of the virus, severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), which has caused the recent pandemic of coronavirus disease (COVID-19), in only a week after receipt of the synthetic DNA fragments. The technical advance that we describe here facilitates rapid responses to emerging viruses as it enables the real-time generation and functional characterization of evolving RNA virus variants during an outbreak.