miR-34a-5pは、CDK6とPI3K/AKT経路を調節することで、胎盤性絨毛細胞の生存率、浸潤、アポトーシスを制御していることが明らかになった

[miR-34a-5p regulates viability, invasion and apoptosis of placental trophoblastic cells modulating CDK6 and PI3K/AKT pathway].

• Qin Li
• Juanxiu Xu

抄録

目的:

ヒト胎盤性絨毛細胞の細胞生存性、アポトーシス、浸潤の調節におけるマイクロRNA(miR)-34a-5pとサイクリン依存性キナーゼ(CDK)6の役割と、miR-34a-5pとCDK6の関係を調べる。

OBJECTIVE: To investigate the roles of microRNA (miR)-34a-5p and cyclin-dependent kinase (CDK) 6 in the regulation of cell viability, apoptosis and invasion of human placental trophoblastic cells and the relationship between miR-34a-5p and CDK6.

方法:

ヒト絨毛癌細胞株BeWoとJEG-3HTR-8/Svneoを培養し、RT-qPCRを用いてmiR-34a-5pの発現を調べた。miR-34a-5p-ミミック、miR-34a-5p-インヒビター、またはpcDNA-CDK6をミミック群と共にトランスフェクトしたHTR-8/Svneo細胞をMTTアッセイを用いて細胞増殖の変化を分析し、細胞のアポトーシスをカスパーゼ3活性および開裂カスパーゼ3タンパク質発現の検出により評価し、細胞浸潤をTranswellアッセイを用いて評価した。ウェスタンブロット法を用いて、細胞内のCDK6、開裂カスパーゼ3、MMP-9のタンパク質レベルを測定した。CDK6とmiR-34a-5pとの相互作用をルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて解析した。

METHODS: We examined the expression of miR-34a-5p using RT-qPCR in cultured human trophoblast HTR-8/Svneo cells and human choriocarcinoma cell lines BeWo and JEG-3HTR-8/Svneo. HTR-8/Svneo cells transfected with a miR-34a-5p-mimic, the miR-34a-5p-inhibitor, or pcDNA-CDK6 along with the mimic group were analyzed for changes in cell proliferation using MTT assay; the apoptosis of the cells were assessed by detecting caspase 3 activity and cleaved caspase 3 protein expression, and the cell invasion was evaluated using Transwell assay. Western blotting was used to determine the protein levels of CDK6, cleaved caspase 3, and MMP-9 in the cells. The interaction between CDK6 and miR-34a-5p analyzed using a luciferase reporter assay.

結果:

miR-34a-5pを導入することにより、培養HTR-8/Svneo細胞の生存率を有意に低下させ（=0.000）、浸潤を抑制し（=0.049）、細胞のアポトーシスを増加させ（=0.018）、MMP-9の発現を低下させ（=0.004）、CDK6の発現を低下させ（=0.014）、カスパーゼ3活性を増加させ（=0.018）、カスパーゼ3の発現を切断し（=0.003）、培養HTR-8/Svneo細胞の生存率を有意に低下させました。CDK6はmiR-34a-5pの標的遺伝子の一つであることが確認された。pcDNA-CDK6を用いたトランスフェクションは、miR-34a-5p過剰発現の細胞生存率(=0.000)、アポトーシス(=0.015)、および浸潤(=0.046)に対する影響を有意に逆転させた。また、PI3K/AKT経路の活性化因子であるインスリン様成長因子1（IGF-1）で細胞を処理すると、miR-34a-5p過剰発現の細胞生存率（=0.011）、アポトーシス（=0.004）、および浸潤（=0.002）に対する効果が有意に減少した。

RESULTS: Transfection with the miR-34a-5p mimic significantly reduced the viability (=0.000), suppressed the invasion (=0.049), enhanced the cell apoptosis (=0.018), down-regulated the expressions of MMP-9 (=0.004) and CDK6 (=0.014), and up-regulated caspase 3 activity (=0.018) and cleaved caspase 3 expression (=0.003) in cultured HTR-8/Svneo cells. CDK6 was confirmed as one of the target gene of miR-34a-5p. Transfection with pcDNA-CDK6 significantly reversed the effects of miR- 34a-5p overexpression on the cell viability (=0.000), apoptosis (=0.015), and invasion (=0.046). Treatment of the cells with insulin-like growth factor 1 (IGF-1), an activator of the PI3K/AKT pathway, also significantly attenuated the effects of miR-34a- 5p overexpression on the cell viability (=0.011), apoptosis (=0.004), and invasion (=0.002).

結論:

miR-34a-5pはCDK6をダウンレギュレーションし、PI3K/AKT経路を不活性化することでアポトーシスを促進し、ヒト胎盤性絨毛細胞の生存と浸潤を抑制する。

CONCLUSIONS: miR-34a-5p promotes apoptosis and inhibits the viability and invasion of human placental trophoblastic cells by down-regulating CDK6 and inactivating the PI3K/AKT pathway.