ラテラルフローディップスティックを用いたリコンビナーゼポリメラーゼ増幅法によるブタのデルタコロナウイルスの迅速かつ視覚的な検出

Rapid and visual detection of porcine deltacoronavirus by recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick.

• Xiang Gao
• Xinsheng Liu
• Yongguang Zhang
• Yanming Wei
• Yonglu Wang

抄録

背景:

Porcine Deltacoronavirus (PDCoV) は、2012 年に中国の香港で初めて確認された新興のコロナウイルスです。その後、PDCoVは世界中で報告されており、多くの新生児子豚の死亡事故を引き起こし、養豚業界に多大な経済的損失をもたらしています。したがって、PDCoVの迅速診断のための高感度かつ特異的な方法を確立する必要があります。

BACKGROUND: Porcine Deltacoronavirus (PDCoV) is a newly emerging Coronavirus that was first identified in 2012 in Hong Kong, China. Since then, PDCoV has subsequently been reported worldwide, causing a high number of neonatal piglet deaths and significant economic losses to the swine industry. Therefore, it is necessary to establish a highly sensitive and specific method for the rapid diagnosis of PDCoV.

結果:

本研究では、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅とラテラルフローディップスティック(LFD-RPA)を組み合わせた高感度かつ特異的な診断法を開発し、PDCoVを迅速かつ視覚的に検出した。10℃から37℃までの幅広い温度条件で行うことができ、37℃では10分でPDCoVの検出が完了します。このアッセイの感度は、PDCoVの検出限界が1×10コピー/μlと低く、従来のPCR法と比較して10倍以上の高感度であった。一方，LFD-RPA法はPDCoVを特異的に増幅したが，豚伝染性下痢ウイルス（PEDV），感染性胃腸炎ウイルス（TGEV）を含む他の豚関連ウイルスとの交差増幅は認められなかった．豚コブウイルス（PKoV）、口蹄疫ウイルス（FMDV）、豚生殖呼吸器症候群ウイルス（PRRSV）、豚サーコウイルス2型（PCV2）、古典的豚熱ウイルス（CSFV）およびセネカバレーウイルス（SVV）。試験結果の再現性から、本アッセイは良好な再現性を有していることが示された。さらに，68例の臨床検体（糞便スワブ検体48例，腸管検体20例）について，LFD-RPAおよびRT-PCR法による検査を行った．その結果，LFD-RPAの陽性率は従来のPCR法（23.53％）よりも26.47％高かった．

RESULTS: In the present study, a highly sensitive and specific diagnostic method using recombinase polymerase amplification combined with a lateral flow dipstick (LFD-RPA) was developed for rapid and visual detection of PDCoV. The system can be performed under a broad range of temperature conditions from 10 to 37 °C, and the detection of PDCoV can be completed in 10 min at 37 °C. The sensitivity of this assay was 10 times higher than that of conventional PCR with a lower detection limit of 1 × 10 copies/µl of PDCoV. Meanwhile, the LFD-RPA assay specifically amplified PDCoV, while there was no cross-amplification with other swine-associated viruses, including Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), Transmissible gastroenteritis virus (TGEV), Porcine kobuvirus (PKoV), Foot and mouth disease virus (FMDV), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Porcine circovirus type 2 (PCV2), Classical swine fever virus (CSFV) and Seneca valley virus (SVV). The repeatability of the test results indicated that this assay had good repeatability. In addition, 68 clinical samples (48 fecal swab specimens and 20 intestinal specimens) were further tested by LFD-RPA and RT-PCR assay. The positive rate of LFD-RPA clinical samples was 26.47% higher than that of conventional PCR (23.53%).

結論:

この研究では、LFD-RPAアッセイは20分以内にPDCoVを検出することに成功し、PDCoVの分子検出を改善し、特にリソースの少ない地域や研究室でPDCoVの発生を監視するための貴重なツールとなる可能性を提供している。

CONCLUSIONS: The LFD-RPA assay successfully detected PDCoV in less than 20 min in this study, providing a potentially valuable tool to improve molecular detection for PDCoV and to monitor the outbreak of PDCoV, especially in low-resource areas and laboratories.