グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼは、Ca1.2と相互作用してCa電流を増加させ、L型カルシウムチャネルの内在性不活性化を減少させる

Glucose-6-phosphate dehydrogenase increases Ca currents by interacting with Ca1.2 and reducing intrinsic inactivation of the L-type calcium channel.

• Rakhee Gupte
• Vidhi Dhagia
• Petra Rocic
• Rikuo Ochi
• Sachin A Gupte

抄録

NADPHやNADHなどのピリジンヌクレオチドは、心臓や血管機能の調節に重要な役割を果たす物質として浮上しています。ペントースリン酸経路の律速酵素であるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）は、細胞内NADPHの主要な供給源であり、調節因子である。今回の研究では、ウシおよびヒトの動脈において、G6PDの2つのアイソフォーム（遅い移動型と速い移動型）を同定し、遅い移動型のG6PDアイソフォーム（G6PD）の機能的特徴を明らかにしました。我々は、G6PDが血管平滑筋（VSM）のカベオラ画分に溶出し、その高速移行性アイソフォーム（G6PD）よりも高い最大反応率（：1.65倍）を有することを発見した。興味深いことに、カベオラエG6PDはL型Caチャネルの孔形成αサブユニットであるCa1.2と複合体を形成しており、固定VSMCにおける近接ライゲーションアッセイによって実証された。さらに、赤色蛍光タンパク質（RFP）タグ付きG6PD（C-G6PD）と緑色蛍光タンパク質（GFP）タグ付きCa1.2-(Ca1.2-GFP)を共トランスフェクトしたHEK293-17T細胞のフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）解析を行ったところ、Ca1.2-GFPとC-G6PDを共トランスフェクトした細胞と比較して、強いFRETシグナルが得られた。さらに、C-G6PDとCa1.2-GFPを共トランスフェクトした細胞では、Ca1.2-GFP単独で発現した細胞に比べて、L型Caチャネルのコンダクタンスが大きく、電圧に依存しないアベイラビリティー成分（）が増加していた。驚くべきことに、G6PD阻害剤であるエピアンドロステロンは、G6PD-Ca1.2複合体を破壊し、また、L型Ca電流と窓電流の振幅を減少させ、それによって成分の可用性を減少させた。さらに、アデノG6PD-GFPの過剰発現は、コントロールと比較して冠動脈のKCl誘発収縮を増強した。G6PDの過剰発現が臨床的な意味を持つかどうかを調べるために、メタボリックシンドローム患者およびラットの動脈におけるG6PD活性を調べたところ、この疾患状態ではG6PD活性が高いことがわかりました。興味深いことに、エピアンドロステロン治療により、メタボリックシンドロームラットの平均動脈血圧と末梢血管抵抗の上昇が減少し、G6PDの活性がメタボリックシンドロームの血管収縮と血圧を増強したことが示唆された。これらのデータは、カベオラ画分における新規なG6PD-Ca1.2相互作用が、チャネルの内在性電圧依存性の不活性化を減少させ、VSM L型Caチャネル機能とCaシグナルの調節に寄与し、それによって生理学的/病態生理学的条件における血管機能の調節に重要な役割を果たしていることを示唆している。本研究では、代謝酵素であるグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ（G6PD）の新規アイソザイムが平滑筋細胞のL型Caイオンチャネル機能と相互作用し、その調節に寄与することを明らかにした。さらに、この新規なG6PDアイソフォームの発現と活性が、メタボリックシンドローム患者の動脈で増加し、メタボリックシンドロームで血圧が低下したラットのG6PD活性の阻害においても増加していることを示している。

Pyridine nucleotides, such as NADPH and NADH, are emerging as critical players in the regulation of heart and vascular function. Glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), the rate-limiting enzyme in the pentose phosphate pathway, is the primary source and regulator of cellular NADPH. In the current study, we have identified two isoforms of G6PD (slow and fast migrating) and functionally characterized the slow migrating isoform of G6PD (G6PD) in bovine and human arteries. We found that G6PD is eluted in the caveolae fraction of vascular smooth muscle (VSM) and has a higher maximum rate of reaction (: 1.65-fold) than its fast migrating isoform (G6PD). Interestingly, caveolae G6PD forms a complex with the pore-forming α-subunit of the L-type Ca channel, Ca1.2, as demonstrated by a proximity ligation assay in fixed VSMCs. Additionally, Förster resonance energy transfer (FRET) analysis of HEK293-17T cells cotransfected with red fluorescent protein (RFP)-tagged G6PD (C-G6PD) and green fluorescent protein (GFP)-tagged Ca1.2-(Ca1.2-GFP) demonstrated strong FRET signals as compared with cells cotransfected with Ca1.2-GFP and C-G6PD. Furthermore, L-type Ca channel conductance was larger and the voltage-independent component of availability () was augmented in C-G6PD and Ca1.2-GFP cotransfectants compared with those expressing Ca1.2-GFP alone. Surprisingly, epiandrosterone, a G6PD inhibitor, disrupted the G6PD-Ca1.2 complex, also decreasing the amplitude of L-type Ca currents and window currents, thereby reducing the availability of the component. Moreover, overexpression of adeno-G6PD-GFP augmented the KCl-induced contraction in coronary arteries compared with control. To determine whether overexpression of G6PD had any clinical implication, we investigated its activity in arteries from patients and rats with metabolic syndrome and found that G6PD activity was high in this disease condition. Interestingly, epiandrosterone treatment reduced elevated mean arterial blood pressure and peripheral vascular resistance in metabolic syndrome rats, suggesting that the increased activity of G6PD augmented vascular contraction and blood pressure in the metabolic syndrome. These data suggest that the novel G6PD-Ca1.2 interaction, in the caveolae fraction, reduces intrinsic voltage-dependent inactivation of the channel and contributes to regulate VSM L-type Ca channel function and Ca signaling, thereby playing a significant role in modulating vascular function in physiological/pathophysiological conditions. In this study we have identified a novel isozyme of glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), a metabolic enzyme, that interacts with and contributes to regulate smooth muscle cell l-type Ca ion channel function, which plays a crucial role in vascular function in physiology and pathophysiology. Furthermore, we demonstrate that expression and activity of this novel G6PD isoform are increased in arteries of individuals with metabolic syndrome and in inhibition of G6PD activity in rats of metabolic syndrome reduced blood pressure.