アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた転写からスプライシングをアンカップリングすることで、抗体クラス切り替えにおける I エクソンドナースプライスサイトの二重の役割が明らかに

Uncoupling Splicing From Transcription Using Antisense Oligonucleotides Reveals a Dual Role for I Exon Donor Splice Sites in Antibody Class Switching.

• Anne Marchalot
• Mohamad Omar Ashi
• Jean-Marie Lambert
• Claire Carrion
• Sandrine Lecardeur
• Nivine Srour
• Laurent Delpy
• Soazig Le Pennec

抄録

クラススイッチ組換え（CSR）は、免疫グロブリンヘビー（）遺伝子座の下流に位置するCμの定数エクソンを異なる定数エクソンに置き換えることにより、抗体のアイソタイプを変化させる。CSRの間、特異的スイッチ（S）領域を介した転写および非コード生殖細胞転写物（GLT）の処理は、活性化誘導性シチジンデアミナーゼ（AID）の標的化に不可欠である。Ｉγ１エクソンドナースプライスサイト（ｄｓｓ）を欠失したマウスではＩγ１に対するＣＳＲは廃止されるが、ＣＳＲにおけるＩエクソンｄｓｓ認識の重要性については多くの疑問が残されている。CSRにおけるIエクソンdssの役割をさらに明らかにするために、まず、Iγ1 dssを欠失したマウスB細胞を活性化した後のS領域におけるRNAポリメラーゼII(RNA pol II)負荷とクロマチンアクセス性を評価した。その結果、Iγ1 dssを欠失すると、Sγ1領域のRNA pol IIの一時停止と活性クロマチンマークが著しく減少することがわかった。次に、GLT上のIエクソンdssをマスキングするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）を用いて、CSRにおけるIエクソンdssの転写後機能に挑戦した。アクセプターSγ1領域のIγ1 dss、またはドナーSμ領域のIμ dssを標的とするASOで刺激したB細胞を処理しても、生殖細胞の転写は減少しなかったが、構成的スプライシングおよびIgG1に対するCSRは強く阻害された。CSRに対するグローバルな効果を裏付けるように、Iμ dssを標的化することでIgG3とIgG2bのアイソタイプに対するCSRが減少することも観察されました。以上のことから、Iエクソンdssの認識がまずRNA pol IIの一時停止と標的とするS領域のクロマチン開口をサポートすること、そして構成的Iエクソンdssを用いたGLTスプライシングイベントがCSRの後のステップに必須であることが明らかになりました。

Class switch recombination (CSR) changes antibody isotype by replacing Cμ constant exons with different constant exons located downstream on the immunoglobulin heavy () locus. During CSR, transcription through specific switch (S) regions and processing of non-coding germline transcripts (GLTs) are essential for the targeting of activation-induced cytidine deaminase (AID). While CSR to IgG1 is abolished in mice lacking an Iγ1 exon donor splice site (dss), many questions remain regarding the importance of I exon dss recognition in CSR. To further clarify the role of I exon dss in CSR, we first evaluated RNA polymerase II (RNA pol II) loading and chromatin accessibility in S regions after activation of mouse B cells lacking Iγ1 dss. We found that deletion of Iγ1 dss markedly reduced RNA pol II pausing and active chromatin marks in the Sγ1 region. We then challenged the post-transcriptional function of I exon dss in CSR by using antisense oligonucleotides (ASOs) masking I exon dss on GLTs. Treatment of stimulated B cells with an ASO targeting Iγ1 dss, in the acceptor Sγ1 region, or Iμ dss, in the donor Sμ region, did not decrease germline transcription but strongly inhibited constitutive splicing and CSR to IgG1. Supporting a global effect on CSR, we also observed that the targeting of Iμ dss reduced CSR to IgG3 and, to a lesser extent, IgG2b isotypes. Altogether, this study reveals that the recognition of I exon dss first supports RNA pol II pausing and the opening of chromatin in targeted S regions and that GLT splicing events using constitutive I exon dss appear mandatory for the later steps of CSR, most likely by guiding AID to S regions.

Copyright © 2020 Marchalot, Ashi, Lambert, Carrion, Lecardeur, Srour, Delpy and Le Pennec.