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マウスNOTCH1からの上皮成長因子様リピート27の発現、精製、グリコシル化
Expression, purification, and glycosylation of epidermal growth factor-like repeat 27 from mouse NOTCH1.
PMID: 32505675 DOI: 10.1016/j.pep.2020.105681.
抄録
Notch受容体は、最大36個のタンデム上皮成長因子様（EGF）リピートを含む大きな細胞外ドメインを有しており、隣接する細胞上のリガンドと結合することで細胞シグナル伝達を促進する。ノッチ受容体は、細胞の運命決定を制御することにより、様々な発生過程において重要な役割を果たしている。各EGFリピートは、3つの保存されたジスルフィド結合を持つ約40個のアミノ酸で構成されています。EGFリピートの多くはO-linked fucose glycanによって修飾されており、半分以上はカルシウム結合部位を持っているが、EGFリピートの配列は様々であり、それぞれのリピートに異なる役割を与えている。マウスNOTCH1のEGFリピート27(EGF27)はO-フコースで修飾されており、NOTCH1の活性化とリガンド結合を制御することが知られている特定のフリンジ酵素によって異なる修飾を受けている7つのリピートのうちの1つである。NOTCH1の機能と制御におけるEGF27の役割をよりよく理解するために、EGF27とその糖鎖形態の3次元構造を追求している。核磁気共鳴分析のために十分な量のEGF27を産生するために大腸菌細胞を用いた。リピートを単独で発現させ、定常的な酸化還元環境下でリピートをリフォールディングするこれまでの試みは、低収率と広範な混合ジスルフィド結合架橋のために成功しなかった。開裂可能なマルトース結合タンパク質融合タグを用いた新しい戦略は、EGF27の溶解度と収率を向上させた。融合タグを用いて、EGF27は正しいジスルフィド結合の配置を生成するようにリフォールディングされ、これはグリコシルトランスフェラーゼ、プロテインO-フコシルトランスフェラーゼ1（POFUT1）とルナティックフリンジ（LFNG）を用いて酵素的に検証された。
Notch receptors have large extracellular domains containing up to 36 tandem epidermal growth factor-like (EGF) repeats, which facilitate cell signaling by binding ligands on neighboring cells. Notch receptors play major roles in a variety of developmental processes by controlling cell fate decisions. Each EGF repeat consists of about 40 amino acids with 3 conserved disulfide bonds. Many of the EGF repeats are modified by O-linked fucose glycans, and more than half have calcium-binding sites, but the sequences of the EGF repeats vary giving distinct roles to each repeat. EGF repeat 27 (EGF27) from mouse NOTCH1 is modified with O-fucose and is 1 of 7 repeats that is differentially modified by specific Fringe enzymes, which are known to regulate NOTCH1 activation and ligand binding. To better understand the role of EGF27 in NOTCH1 function and regulation, the 3-dimensional structures of EGF27 and its glycoforms are being pursued. E. coli cells were used to produce EGF27 in sufficient quantities for nuclear magnetic resonance analysis. Previous attempts to express the repeat alone and refold the repeat under a steady redox environment were unsuccessful due to low yields and extensive mixed-disulfide bond cross-linking. A new strategy using a cleavable maltose binding protein fusion tag increased the solubility and yield of EGF27. With the fusion tag, EGF27 was refolded to produce the correct disulfide bond arrangement, which was verified enzymatically with the glycosyltransferases, Protein O-fucosyltransferase 1 (POFUT1) and Lunatic Fringe (LFNG).
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