α-ジストロブレビンのリン酸化は、αkapの蓄積とアセチルコリン受容体の安定性に不可欠である

Phosphorylation of α-dystrobrevin is essential for αkap accumulation and acetylcholine receptor stability.

• Po-Ju Chen
• Diego Zelada
• Dina Cheryne Belhasan
• Mohammed Akaaboune

抄録

アセチルコリン受容体（AChR）の高密度の維持は、神経筋接合部の特徴です。カルシウム/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼIIα（CAMK2A）遺伝子内にコードされた筋特異的アンカータンパク質（αkap）は、生体内および培養筋細胞内でのAChRクラスターの維持に不可欠である。αkapが維持され、制御される基礎的なメカニズムは不明のままである。ここでは、ヒト細胞株、蛍光顕微鏡、プルダウンおよび免疫ブロッティングアッセイを用いて、ジストロフィン糖タンパク質複合体の細胞内成分であるα-ジストロブレビン（α-dbn）が、濃度依存的な方法でαkapの安定性を直接かつ強固に促進することを示す。その結果、α-dbnのリン酸化可能なチロシン残基がα-dbn自身の安定性とα-dbnとの相互作用に必須であることが明らかになった。α-dbnのC末端の3つのチロシン残基をフェニルアラニンで置換すると、αkapとα-dbnの相互作用が損なわれ、αkapとα-dbnの両方の蓄積が大幅に減少します。さらに、αkap-α-dbn相互作用はαkapの蓄積と安定性に重要であることを明らかにした。また、αkapまたはα-dbnの非存在下ではAChRαの蓄積が著しく減少し、α-dbnまたはαkapを培養筋細胞で過剰発現させると、アグリン誘導性の大きなAChRクラスターの形成が促進されることも明らかにした。これらの結果は、αkapとα-dbnの複合体の安定性がAChRの高発現維持に重要な役割を果たしていることを示唆している。

The maintenance of a high density of the acetylcholine receptor (AChR) is the hallmark of the neuromuscular junction. Muscle-specific anchoring protein (αkap) encoded within the calcium/calmodulin-dependent protein kinase II α (CAMK2A) gene is essential for the maintenance of AChR clusters both in vivo and in cultured muscle cells. The underlying mechanism by which αkap is maintained and regulated remains unknown. Here, using human cell lines, fluorescence microscopy, and pulldown and immunoblotting assays, we show that α-dystrobrevin (α-dbn), an intracellular component of the dystrophin glycoprotein complex, directly and robustly promotes the stability of αkap in a concentration-dependent manner. Mechanistically, we found that the phosphorylatable tyrosine residues of α-dbn are essential for the stability of α-dbn itself and its interaction with αkap, with substitution of three tyrosine residues in the α-dbn C-terminus with phenylalanine compromising the αkap-α-dbn interaction and significantly reducing both αkap and α-dbn accumulation. Moreover, the αkap-α-dbn interaction was critical for αkap accumulation and stability. We also found that the absence of either αkap or α-dbn markedly reduces AChRα accumulation and that overexpression of α-dbn or αkap in cultured muscle cells promotes the formation of large agrin-induced AChR clusters. Collectively, these results indicate that the stability of αkap and α-dbn complex plays an important role in the maintenance of high-level expression of AChRs.

Published under license by The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.