URNW由来の新規リチン化酵素LysCの分子特性と正電荷-末端伸長を介した抗菌活性

Molecular Characterization of a Novel Lytic Enzyme LysC from URNW and Its Antibacterial Activity Mediated by Positively Charged -Terminal Extension.

• Magdalena Plotka
• Monika Szadkowska
• Maria Håkansson
• Rebeka Kovačič
• Salam Al-Karadaghi
• Björn Walse
• Olesia Werbowy
• Anna-Karina Kaczorowska
• Tadeusz Kaczorowski

抄録

ペプチドグリカン加水分解酵素は、細菌感染症との戦いにおいて、従来の抗生物質に代わる有望な手段と考えられている。新規な加水分解酵素を同定するために、我々の研究室で以前に研究されていた高い殺菌活性を持つ2つの耐熱性エンドリシンの配列を用いてデータベース検索を行った。これらの酵素はいずれもバクテリオファージMAT2119およびvB_Tsc2631に由来するものである。URNWからの溶解酵素LysCは、バクテリオファージのタンパク質と最も高いアミノ酸配列類似性を有することが判明し、さらなる分析のために選択されました。組換え酵素は、宿主バクテリオファージ、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 。タンパク質の結晶学的研究は、LysC の触媒部位がアミノ酸残基 His、His、および Cys によって配位された亜鉛原子を含むことを示し、これはタイプ 2 アミダーゼに特徴的な特徴である。驚くべきことに、LysCの抗菌活性を維持するためには、これらのアミノ酸残基はもちろんのこと、活性部位近傍の4つの保存残基、His, Thr, Tyr, Thrのいずれも必須ではありませんでした。そのため、私たちは、酵素の本質的に乱れた正電荷を帯びた-末端領域に注目しました。AMPA（Antimicrobial Sequence Scanning System）によって予測されたこの部分の潜在的な抗菌活性を実験的に確認したところ、LysCの切り捨て版（LysCΔ2-23）は完全に抗菌活性を欠いていました。さらに、LysCの最初の30アミノ酸と同一の配列を持つ合成ペプチド（Intestinalin）は、6μg/mL（1.5μM）のICで実質的な抗スタフィロコッカス活性を示した。このペプチドは，洗浄剤の存在下での溶液中でのα-ヘリカル構造を有していることが示され，これは両親媒性α-ヘリカル抗菌ペプチドの共通の特徴である．

Peptidoglycan hydrolytic enzymes are considered to be a promising alternative to conventional antibiotics in combating bacterial infections. To identify novel hydrolytic enzymes, we performed a database search with the sequences of two thermostable endolysins with high bactericidal activity, studied earlier in our laboratory. Both these enzymes originate from bacteriophages MAT2119 and vB_Tsc2631. A lytic enzyme LysC from URNW was found to have the highest amino acid sequence similarity to the bacteriophage proteins and was chosen for further analysis. The recombinant enzyme showed strong activity against its host bacteria , as well as against , , and , on average causing a 5.12 ± 0.14 log reduction of viable ATCC 25923 cells in a bactericidal assay. Crystallographic studies of the protein showed that the catalytic site of LysC contained a zinc atom coordinated by amino acid residues His, His, and Cys, a feature characteristic for type 2 amidases. Surprisingly, neither of these residues, nor any other of the four conserved residues in the vicinity of the active site, His, Thr, Tyr, and Thr, were essential to maintain the antibacterial activity of LysC. Therefore, our attention was attracted to the intrinsically disordered and highly positively charged -terminal region of the enzyme. Potential antibacterial activity of this part of the sequence, predicted by the Antimicrobial Sequence Scanning System, AMPA, was confirmed in our experimental studies; the truncated version of LysC (LysCΔ2-23) completely lacked antibacterial activity. Moreover, a synthetic peptide, which we termed Intestinalin, with a sequence identical to the first thirty amino acids of LysC, displayed substantial anti-staphylococcal activity with IC of 6 μg/mL (1.5 μM). This peptide was shown to have α-helical conformation in solution in the presence of detergents which is a common feature of amphipathic α-helical antimicrobial peptides.