近接-指数関数的ハイブリダイゼーション連鎖反応(PEHCR)とその応用による生細胞上の膜タンパク質-タンパク質相互作用の非破壊分析

A proximity-exponential hybridization chain reaction (PEHCR) and its application for nondestructive analysis of membrane protein-protein interactions on living cells.

• Dongsheng Mao
• Tianshu Chen
• Xiaohao Liu
• Lingjie Ren
• Chang Feng
• Guifang Chen

抄録

膜蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）の解析には様々な方法が開発されているが、その場での増幅・動的・非破壊解析は常に課題である。この問題を解決するために、私たちは、近接-指数関数的ハイブリダイゼーション連鎖反応（PEHCR）と呼ばれる手法を開発しました。この方法では、2つの膜タンパク質が相互作用により接近すると、それぞれのオリゴヌクレオチド標識抗体を引き寄せます。その後、オリゴヌクレオチドが近接することで、酵素を含まない指数関数的ハイブリダイゼーション連鎖反応が起こり、増幅された蛍光イメージング信号を出力することができます。モデルとして、異なる活性化剤や阻害剤の制御下でのEGFR-HER2相互作用の解析を実現しています。また、シグナル増幅性能に優れていることから、一般的な蛍光顕微鏡を用いて膜PPIを明確に観察することができます。さらに、酵素を必要とする既存の近接技術とは異なり、我々の酵素フリー戦略は、酵素触媒に適した特定のバッファーを使用する必要がなく、細胞の生理活性を最大化するために、細胞の液体培地中で直接実行することができます。したがって、生きている細胞上の膜PPIの動的分析が達成され、分析後の細胞は、まだ生きていて、他の使用のために利用可能である。本研究の成功は、特に少量の不均一な細胞集団における膜PPIの研究のためのツールボックスを豊かにします。

Though a variety of methods have been developed for the analysis of membrane protein-protein interactions (PPIs), amplified, dynamic and nondestructive analysis in situ is always a challenge. To address this issue, here we develop a method called proximity-exponential hybridization chain reaction (PEHCR). In our strategy, when two membrane proteins approach due to interaction, they will draw their respective oligonucleotide-labeled antibodies together. The proximity of the oligonucleotides thereafter triggers a well-designed enzyme-free exponential hybridization chain reaction, which can output amplified fluorescence imaging signals. As a model, analysis of EGFR-HER2 interactions under the regulation of different activators and inhibitors is achieved. Owing to the superior signal amplification performance, we are able to clearly observe the membrane PPIs by using a common fluorescence microscope. Furthermore, unlike the existing proximity techniques that require enzymes, our enzyme-free strategy avoids the need to use a specific buffer suitable for enzyme catalysis and can be run directly in cell liquid media to maximize the physiological activity of the cells. So, dynamic analysis of membrane PPIs on living cells is achieved, and the cells, after the analysis, are still alive and are available for other usage. The successful implementation of this work enriches the toolbox for the study of membrane PPIs especially on those heterogeneous cell populations with small amount.

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