6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメートを用いたプレカラム誘導体化による注射剤製剤中のガニレリクス酢酸塩のアミノ酸組成の決定

Determination of Amino Acid Composition of Ganirelix Acetate in an Injectable Formulation by Pre-column Derivatization with 6-Aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl Carbamate.

• Kumarswamy Ummiti
• J V Shanmukha Kumar

抄録

ガニエリックスは、９種類のアミノ酸で連結された合成デカペプチドである。ペプチドのアミノ酸配列または一次構造を理解するために、まず最初のステップは、ペプチドの免疫原性の決定因子となり得るペプチドのアミノ酸組成を決定することです。エドマン分解は、荷電されていないＮ末端アミノ基の不在のために、Ganirelixに存在するアミノ酸配列を同定するのに適した分析技術ではない。この課題を解決するために、6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシンイミジルカルバメート試薬を用いたプレカラム誘導体化法を開発した。本研究では、注射剤中に存在するガニレリクス有効成分を分画回収により単離し、さらにフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。ガニレリクスのアミノ酸組成は、1%フェノールを含む6molL-1塩酸水溶液を用いて100℃で24時間酸加水分解を行い、6-アミノキノリル-N-ヒドロキシスクシニミジルカルバメート試薬溶液で誘導体化した後、C18カラムを用いた逆相クロマトグラフィーで個々のアミノ酸を定量することにより測定しており、9種類のアミノ酸について高分解能を達成しています。9種類のアミノ酸混合物について高分解能が得られた。温度ストレスをかけたガニアリックスジェネリック製剤と参考記載薬のアミノ酸組成の結果は、ラベル情報の理論モル比とよく一致していた。

Ganirelix is a synthetic decapeptide linked with nine different amino acids. To understand the peptide amino acid sequence or primary structure, the first step is to determine the amino acid composition of the peptide which can be a determining factor for the peptide immunogenicity. Edman degradation is not a suitable analytical technique to identify amino acid sequence present in Ganirelix due to the absence of uncharged N-terminal amino group. To address this challenge, a pre-column derivatization method was developed with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate reagent. In the present work, the Ganirelix active pharmaceutical ingredient present in the injectable formulation was isolated by fraction collection and further purified by flash chromatography. The amino acid composition of Ganirelix is assayed by carrying out acid hydrolysis with 6 mol L-1 hydrochloric acid solution containing 1% phenol at 100°C for 24 h and derivatization with 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate reagent solution, followed by determination of individual amino acids by reverse-phase chromatography using a C18 column. High resolution was achieved for the nine amino acid mixture. The amino acid composition results of temperature-stressed Ganirelix generic product and reference listed drug are in good agreement with the theoretical molar ratio of label information.

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