CHO細胞における抗PCSK9バイオシミラーモノクローナル抗体の発現のための異なるIRES介在型三色プラスミドデザインの評価

Evaluation of different IRES-mediated tricistronic plasmid designs for expression of an anti-PCSK9 biosimilar monoclonal antibody in CHO cells.

• Thayana A Cruz
• Marcos B Pinho
• Leda R Castilho

抄録

目的:

異なるシグナルペプチド、IRES要素、および選択マーカーを組み合わせたIRES媒介型三色プラスミドベクターを用いて、CHO細胞における抗PCSK9バイオシミラーモノクローナル抗体（mAb）の発現のための異なるアプローチを比較するために。

OBJECTIVES: To compare different approaches for the expression of an anti-PCSK9 biosimilar monoclonal antibody (mAb) in CHO cells using IRES-mediated tricistronic plasmid vectors combining different signal peptides, IRES elements and selection markers.

結果:

一過性のトランスフェクションは、すべてのコンストラクトについて、トランスフェクション後48時間後に分泌されたmAbの同程度のレベルを示した。しかしながら、円形プラスミドを用いて実施されたトランスフェクションは、直線化プラスミドを用いた場合よりも高い発現を示した。選択圧下で２ヶ月後には、トランスフェクションしたプールの一部のみが回復した。二重選択のための選択マーカーとして2種類の抗生物質を用いて共トランスフェクトした培養物は回復しなかった。その結果、安定したプールの一部のみが回復したトランスフェクションプールの成長、代謝およびmAb産生プロファイルを比較し、より高い細胞成長およびmAb産生のため、円形L1-LC-IRES-H7-HC-IRES-NEOプラスミドでトランスフェクションした安定したプールをさらなる研究のために選択した。純度、均質性、PCSK9への結合親和性、アミノ酸配列など、タンパク質A精製mAbの重要な品質属性を評価し、本研究で採用されたアプローチの成功を確認した。

RESULTS: Transient transfection indicated a similar level of secreted mAb 48 h post-transfection for all constructs. However, transfections carried out with circular plasmids showed a higher expression than with linearized plasmids. After two months under selection pressure, only part of the transfected pools recovered. The cultures co-transfected using two antibiotics as selection markers for double selection did not recover. Growth, metabolism and mAb production profiles of the only part of the transfected pools recovered resulting stable pools were compared and the stable pool transfected with circular L1-LC-IRES-H7-HC-IRES-NEO plasmid was chosen for further studies, due to higher cell growth and mAb production. Critical quality attributes of the protein A-purified mAb such as purity, homogeneity, binding affinity to PCSK9, and amino acid sequence were assessed confirming the success of the approach adopted in this study.

結論:

提案した発現プラットフォームは、安定したCHO細胞プールで高品質の抗PCSK9 mAbを効率的に生産できることを示し、特徴付け、製剤化研究、前臨床試験のための様々なmAbを迅速に生産するためのベンチマークを提供します。

CONCLUSIONS: The expression platform proposed showed to be efficient to produce a high-quality anti-PCSK9 mAb in stable CHO cell pools and provides benchmarks for fast production of different mAbs for characterization, formulation studies and pre-clinical investigation.