ヒマラヤ北西部のヒツジから分離された種の分子解析と免疫診断法

Molecular characterization and immunodiagnostics of species isolated from sheep of north-west Himalayan region.

• J S Dar
• U Shabir
• S A Dar
• B A Ganai

抄録

放牧された反芻動物の間で広く存在しているにもかかわらず、「小肝斑病」としても知られるジクロコエリオーシスは、多くの国の研究者や専門家にはあまり知られておらず、過小評価されていることが多いです。ジクロコエリオーシスの正確な同定と事前診断は、その予防と制御のために不可欠な前提条件である。本研究では，ヒツジ（Ovis aries）の胆管から分離された形態学的に同定された検体を分子データを用いて検証した。本研究で分離した検体の第2内接スペーサー（ITS-2）の配列解析を行ったところ、国立生物工学情報センター（NCBI）のBLAST機能を用いて、D. dendriticumと高い類似性が認められた。また、本研究で得られた分離株の系統解析を行ったところ、これまでに報告されている各国のD. dendriticum分離株との間には密接な関係があることがわかった。D. dendriticumの体性抗原および排泄物/分泌物（E/S）抗原の抗原プロファイルをドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）および自然感染した羊の血清を用いた免疫ブロット法により明らかにした。SDS-PAGEにより、粗体細胞画分から16個の異なるバンドが明らかになった。これらのタンパク質を陽性の血清を用いてイムノブロット解析したところ、27～130 kDaの範囲で6つの血清反応性バンドが認められた。これらのバンドのうち、84および130 kDaのバンドは非常に特異的であり、高い診断特異性と感度を有していた。E/S画分では、SDS-PAGE分析により、9つの異なるバンドが検出された。これらのタンパク質を陽性血清とイムノブロット分析したところ、27～130 kDaの5つの抗原性バンドが確認された。その中で130 kDaのバンドは非常に特異的であり，診断特異性と感度が高いことがわかった。本研究では，体細胞画分に84，130 kDa，E/S画分に130 kDaのタンパク質バンドが存在することから，この経済的に重要な寄生虫の免疫診断に利用できると考えられ，ワクチンの可能性についてのさらなる研究を促進する可能性があると結論づけた。

Despite its extensive presence among grazing ruminants, dicrocoeliosis, also known as 'small liver fluke' disease, is poorly known and often underestimated by researchers and practitioners in many countries. The accurate identification and prepatent diagnosis of Dicrocoelium dendriticum infection is an essential prerequisite for its prevention and control. In the present study, the morphologically identified specimens isolated from the bile ducts of sheep (Ovis aries) were validated through molecular data. The sequence analysis of the second internal transcribed spacer (ITS-2) of our isolates showed a high degree of similarity with D. dendriticum using the BLAST function of the National Center for Biotechnology Information (NCBI). The phylogenetic analysis of our isolates showed a close relationship with previously described D. dendriticum isolates from different countries. The antigenic profiles of somatic and excretory/secretory (E/S) antigens of D. dendriticum were revealed by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting using sera from sheep naturally infected with D. dendriticum. By SDS-PAGE, 16 distinct bands were revealed from crude somatic fraction. Immunoblotting analysis of these proteins with positive sera exhibited six seroreactive bands ranging from 27 to 130 kDa. Among these, the 84 and 130 kDa bands were quite specific, with high diagnostic specificity and sensitivity. The E/S fraction comprised nine distinct bands, as revealed by SDS-PAGE analysis. Immunoblotting analysis of these proteins with positive sera exhibited five antigenic bands ranging from 27 to 130 kDa. Among these, the 130 kDa band was found to be quite specific, with high diagnostic specificity and sensitivity. The present study concludes that the protein bands of 84 and 130 kDa in somatic fraction and 130 kDa in E/S fraction can be used for the immunodiagnostic purpose for this economically important parasite, which may also encourage further studies regarding their vaccine potential.