CCN6はミトコンドリア呼吸器複合体の組み立てと活性を制御している

CCN6 regulates mitochondrial respiratory complex assembly and activity.

• Deepesh Kumar Padhan
• Archya Sengupta
• Milan Patra
• Ananya Ganguly
• Sushil Kumar Mahata
• Malini Sen

抄録

細胞伝達ネットワーク因子6（CCN6）の変異は、衰弱性の筋骨格系疾患である進行性偽性リウマチ性異形成（PPRD）と関連している。CCN6の機能やPPRDの発症機序については不明な点が多い。そこで我々は、CCN6およびCCN6変異体の機能解析に着目した。サイズ排除クロマトグラフィーとネイティブポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて、CCN6がヒト軟骨細胞株のミトコンドリア呼吸器複合体の構成要素として存在することを明らかにした。siRNAを介したトランスフェクションと電子顕微鏡を用いて、CCN6の発現を適度に減少させることで、RERとミトコンドリアの膜間距離が減少することを示した。さらに、ネイティブPAGE、免疫ブロッティング、コンプレックスI活性アッセイを並行して行ったところ、CCN6欠乏細胞では、ミトコンドリアにおけるCCN6の分布とミトコンドリア呼吸器複合体の集合体/活性の両方が増加していることが明らかになった。また、CRISPR-Cas9技術を用いて作製したPPRDに類似したCCN6変異体は、変異体CCN6タンパク質の発現レベルが低く、呼吸器複合体の集合体/活性が抑制されていた。また、電子顕微鏡とMTTアッセイにより、変異体のミトコンドリアに異常が見られ、細胞の生存率が低下していることが明らかになった。これらの結果から、CCN6はRERとミトコンドリアの近接性を制御することでミトコンドリア呼吸複合体の一部としてミトコンドリア呼吸複合体の集合/活性を制御しており、CCN6変異体はミトコンドリア呼吸複合体の集合/活性を阻害し、その結果、ミトコンドリアの異常や細胞の生存能力の低下を引き起こすことが示唆された。

Cellular communication network factor 6 (CCN6) mutations are linked with Progressive Pseudo Rheumatoid Dysplasia (PPRD) a debilitating musculoskeletal disorder. The function of CCN6 and the mechanism of PPRD pathogenesis remain unclear. Accordingly, we focused on the functional characterization of CCN6 and CCN6 mutants. Using size exclusion chromatography and native polyacrylamide gel electrophoresis we demonstrated that CCN6 is present as a component of the mitochondrial respiratory complex in human chondrocyte lines. By means of siRNA-mediated transfection and electron microscopy we showed that moderate reduction in CCN6 expression decreases the RER- mitochondria inter-membrane distance. Parallel native PAGE, immunoblotting and Complex I activity assays furthermore revealed increase in both mitochondrial distribution of CCN6 and mitochondrial respiratory complex assembly/activity in CCN6 depleted cells. CCN6 mutants resembling those linked with PPRD, which were generated by CRISPR-Cas9 technology displayed low level of expression of mutant CCN6 protein and inhibited respiratory complex assembly/activity. Electron microscopy and MTT assay of the mutants revealed abnormal mitochondria and poor cell viability. Taken together, our results indicate that CCN6 regulates mitochondrial respiratory complex assembly/activity as part of the mitochondrial respiratory complex by controlling the proximity of RER with the mitochondria, and CCN6 mutations disrupt mitochondrial respiratory complex assembly/activity resulting in mitochondrial defects and poor cell viability.

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