CpGシングルサイトメチル化は歯根膜炎患者の炎症性PBMCにおけるTLR2発現を制御する

CpG Single-Site Methylation Regulates TLR2 Expression in Proinflammatory PBMCs From Apical Periodontitis Individuals.

抄録

はじめに:

根尖性歯周炎（AP）は、歯の根管システムの感染による歯根周囲組織の炎症性破壊によって引き起こされる一般的な口腔疾患である。APはまた、末梢単核球（PBMC）がキャリアとして作用する全身的な細菌移行にも寄与する。Toll様受容体（TLR）2は、感染に対する反応を媒介し、炎症反応を活性化する。DNAメチル化は細菌によって誘導され、この反応の調節に寄与する。免疫炎症性疾患へのPBMCの関与を支持する証拠があるにもかかわらず、AP患者におけるPBMCの炎症プロファイルやエピジェネティック制御機構は不明である。

INTRODUCTION: Apical periodontitis (AP) is a common oral disease caused by the inflammatory destruction of the periapical tissues due to the infection of the root canal system of the tooth. It also contributes to systemic bacterial translocation, where peripheric mononuclear blood cells (PBMCs) can act as carriers. Toll-like receptor (TLR) 2 mediates the response to infection and activates inflammatory responses. DNA methylation can be induced by bacteria and contributes to the modulation of this response. Despite the evidence that supports the participation of PBMCs in immune-inflammatory disorders, the inflammatory profile and epigenetic regulatory mechanisms of PBMCs in AP individuals are unknown.

目的:

APにおけるPBMCのTLR2遺伝子メチル化と炎症プロファイルを明らかにすること。

AIM: To determine TLR2 gene methylation and inflammatory profiles of PBMCs in AP.

方法:

横断的探索研究。それ以外の健常AP患者（n=27）とコントロール（n=30）を対象とした。PMBCをフィコール勾配で分離し、24時間培養し、RNAとDNAを抽出した。DNAを重亜硫酸塩処理し、TLR2遺伝子のプロモーター領域の特定部位を、有効なプライマーを用いてqPCRで増幅した。増幅を確認するため、アガロースゲルを行った。TLR2のmRNA発現をqPCRで測定した。105種類の炎症性メディエーターの可溶性レベルは、まずProteome Profiler Human Cytokine Array Kitを用いて調べた。その結果、腫瘍壊死因子（TNF）-α、インターロイキン（IL）-6、IL-10、IL-6Rα、IL-1β、IL-12p70レベルがMultiplex assayで測定された。

METHODS: Cross-sectional exploratory study. Otherwise, healthy individuals with AP (n=27) and controls (n=30) were included. PMBCs were isolated by a Ficoll gradient, cultured for 24 hours, and both RNA and DNA were extracted. DNA was bisulfite-treated, and specific sites at the promoter region of the TLR2 gene were amplified by qPCR using validated primers. To verify its amplification, agarose gels were performed. Then, the PCR product was sequenced. mRNA expression of TLR2 was determined by qPCR. The soluble levels of 105 inflammatory mediators were first explored with Proteome Profiler Human Cytokine Array Kit. Consequently, tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6, IL-10, IL-6Rα, IL-1β, and IL-12p70 levels were measured by Multiplex assay.

結果:

AP患者のPBMCは、コントロールと比較してTNF-α、IL-6、IL-1βの高い可溶性レベルを示す炎症性プロファイルを示した（p<0.05）。TLR2の発現が高く、この遺伝子のプロモーター領域のグローバルなメチル化パターンが対照群と比較して高いことがAPで認められた（p<0.05）。166位と-146位のCpGシングルサイトは完全にメチル化されていたが、-102位はAPの有無とは無関係に全くメチル化されていなかった。77位と+24位のCpGシングルサイトのDNAメチル化は、TLR2の発現と正の相関があった。

RESULTS: PBMCs from individuals with AP demonstrated a proinflammatory profile showing higher soluble levels of TNF-α, IL-6, and IL-1β compared to controls (p<0.05). Higher TLR2 expression and higher global methylation pattern of the promoter region of the gene were found in AP compared to controls (p<0.05). The CpGs single-sites at positions -166 and -146 were completely methylated, while the site -102 was totally unmethylated, independently of the presence of AP. DNA methylation of CpG single-sites in positions -77 and +24 was positively associated with TLR2 expression.

結論:

AP被験者のPBMCは、TLR2遺伝子プロモーターからのCpGシングルサイトのメチル化と関連して、炎症亢進の表現型とTLR2のアップレギュレーションを示し、それによって歯周病性歯内療法患者における持続的な全身性炎症負荷に寄与している。

CONCLUSIONS: PBMCs from AP subjects show a hyperinflammatory phenotype and TLR2 upregulation in association with single CpG-sites' methylation from the TLR2 gene promoter, thereby contributing to a sustained systemic inflammatory load in individuals with periapical endodontic diseases.