NKG7と細胞分解タンパク質を含むNK細胞由来細胞外小胞の細胞分解サブ集団の分離

Isolation of a cytolytic subpopulation of extracellular vesicles derived from NK cells containing NKG7 and cytolytic proteins.

抄録

NK細胞は、細胞分解タンパク質を放出することで、悪性細胞を広く標的として殺傷することができる。NK細胞はまた、細胞溶解性タンパク質を含む細胞外小胞（EV）を放出し、様々ながん細胞のアポトーシスを誘導することがこれまでに示されている.また、NK細胞は、細胞溶解性タンパク質を含む細胞外小胞（EV）を放出する。NK細胞が放出するEVは、細胞膜から放出される場合と、細胞内の異なるコンパートメントから放出される場合があり、非常に不均一であることが予想される。本研究では、細胞溶解性NK-EVを濃縮するための分画スキームを実施した。NK-EVは、無血清で培養したヒトNK-92細胞株または初代ヒトNK細胞の培養液から採取した。超遠心分離と下流の密度勾配超遠心法またはサイズ排除クロマトグラフィーを組み合わせることで、異なるEV集団を同定した。密度勾配超遠心法では、EVの3つの亜集団が分離された。その結果、1つの集団は主に細胞膜タンパク質とテトラスパニンCD37、CD82、CD151に富み、マイクロベシクルと考えられることが分かった。もう一つのサブ集団は、エンドソームテトラスパニンCD63と細胞内小器官のマーカーが高発現しており、細胞内由来のマーカーに富んでいた。細胞内由来のEVは、細胞分解性タンパク質に富み、HCT-116結腸癌スフェロイドに対して高いアポトーシス活性を有していた。さらに細胞溶解性EVを濃縮するために、イムノアフィニティープルダウンにより、細胞溶解性顆粒マーカーNKG7と小胞性グランザイムB含量の大部分を含むEVのサブセットを単離した。したがって、細胞分解タンパク質を含むEVは、主に放出された細胞分解顆粒である可能性が示唆された。

NK cells can broadly target and kill malignant cells release of cytolytic proteins. NK cells also release extracellular vesicles (EVs) that contain cytolytic proteins, previously shown to induce apoptosis of a variety of cancer cells and . The EVs released by NK cells are likely very heterogeneous, as vesicles can be released from the plasma membrane or from different intracellular compartments. In this study, we undertook a fractionation scheme to enrich for cytolytic NK-EVs. NK-EVs were harvested from culture medium from the human NK-92 cell line or primary human NK cells grown in serum-free conditions. By combining ultracentrifugation with downstream density-gradient ultracentrifugation or size-exclusion chromatography, distinct EV populations were identified. Density-gradient ultracentrifugation led to separation of three subpopulations of EVs. The different EV isolates were characterized by label-free quantitative mass spectrometry and western blotting, and we found that one subpopulation was primarily enriched for plasma membrane proteins and tetraspanins CD37, CD82, and CD151, and likely represents microvesicles. The other major subpopulation was enriched in intracellularly derived markers with high expression of the endosomal tetraspanin CD63 and markers for intracellular organelles. The intracellularly derived EVs were highly enriched in cytolytic proteins, and possessed high apoptotic activity against HCT-116 colon cancer spheroids. To further enrich for cytolytic EVs, immunoaffinity pulldowns led to the isolation of a subset of EVs containing the cytolytic granule marker NKG7 and the majority of vesicular granzyme B content. We therefore propose that EVs containing cytolytic proteins may primarily be released cytolytic granules.