段階的ヒト胚における断片化表現型の顕微鏡的・生化学的研究

A microscopic and biochemical study of fragmentation phenotypes in stage-appropriate human embryos.

• J Van Blerkom
• P Davis
• S Alexander

抄録

細胞質断片の多形集団の発生は、体外受精初期のヒト胚の共通の特徴である。ここでは、断片化の時間的、空間的、微細な構造的、生化学的側面を、培養の最初の3.5日の間に段階的に適切と分類された単精子期および分精子期の前核期から早期切断期のヒト胚の断片化について検討した。断片化の一般的なパターンの形態力学、断片の動きと組成を、タイムラプスビデオ、ミトコンドリア蛍光プローブ、透過型電子顕微鏡を用いて解析した。血漿膜と核内DNAの完全性は、アネキシンV染色、末端デオキシヌクレオチドルトランスフェラーゼ媒介dUTPニックエンドラベリング（TUNEL）および単細胞アルカリゲル電気泳動（コメット）アッセイによって評価された。影響を受けた胚の発達能力は、胚移植後の転帰と関連していた。この結果は、ヒトの初期胚に影響を及ぼすある種の一般的な自然断片化は致死的なものではないこと、また、見かけ上の断片の集合体はしばしば一過性の構造であり、再吸収や溶解によって消失することを示している。この知見は、これらの表現型に特徴的な断片の発生および運命が、ブラストメアおよびミトコンドリアの一過性および局所的なATP欠乏および細胞外断片の欠乏または不在に関連した癌化のようなプロセスに関連している可能性を示唆している。

The occurrence of a pleiomorphic population of cytoplasmic fragments is a common characteristic of early human embryos fertilized in vitro. Here, temporal, spatial, fine structural, and biochemical aspects of fragmentation were examined in fragmented monospermic and dispermic pronuclear to early cleavage stages human embryos classified as stage-appropriate during the first 3.5 days of culture. The morphodynamics of certain common patterns of fragmentation and the movement and composition of fragments were analysed by time-lapse video, mitochondrial fluorescent probes, and transmission electron microscopy. Plasma membrane and nuclear DNA integrity were assessed by annexin V staining, and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end-labelling (TUNEL) and single-cell alkaline gel electrophoresis ('comet') assays respectively. Developmental competence for affected embryos was related to outcome after embryo transfer. The results demonstrate that certain common forms of spontaneous fragmentation affecting early human embryos are not lethal, and that clusters of apparent fragments are often transient structures, which disappear by resorption or lysis. The findings suggest that the occurrence and fate of fragments characteristic of these phenotypes may be related to oncosis-like processes associated with transient and focal ATP deficiencies in blastomeres and mitochondrial deficiencies or absence in extracellular fragments.