サバイビンを標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによるK562細胞の分化誘導

[Differentiation of K562 cells induced by antisense oligonucleotide targeting survivin].

• Xian-hao Wen
• You-hua Xu

抄録

目的:

白血病の遺伝子治療は新しい有効な方法である。白血病の発症と発生には様々な遺伝子が関係していることは誰もが知っている。サバイビンは、アポトーシス蛋白質の阻害剤（ＩＡＰ）の一種である。そのcDNAは標的細胞プロテアーゼ受容体-1（EPR-1）からクローニングされた。一般的な腫瘍では発現しているが、正常組織や成熟組織では発現していない。白血病細胞ではサバイビンの高発現が検出された。本研究では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、白血病細胞の分化におけるサバイビンの役割を検討した。

OBJECTIVE: Gene therapy of leukemia is a new and effective method. It is known to all that the pathogenesis and development of leukemia are related to a variety of genes. Survivin is a member of inhibitors of apoptotic proteins (IAP). Its cDNA was cloned from target cell protease receptor-1 (EPR-1). It is expressed in common tumors, but there is no expression in normal and mature tissues. High expression of survivin was detected in leukemic cells. The present study was conducted to examine the role of survivin in the differentiation of leukemic cells by using antisense-oligonucleotides.

方法:

ヒト白血病細胞K562をモデルとした。K562細胞を、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASON）群、ノンセンスオリゴヌクレオチド（NSON）群、リポフェクチン群、対照群の4群に無作為に分けた。実験は各群5検体で、3回繰り返した。ＡＳＯＮは、サバイビンｍＲＮＡを標的とすることを参考にして設計した。K562細胞を、牛胎児血清を含むRPMI1640中で約10％の濃度で培養した。細胞トランスフェクションをリポフェクチンで誘導した。トランスフェクションから４８時間後に形態および超微細構造を観察した。また、トランスフェクションの24時間後および48時間後には、K562細胞の機能をベンジジン染色、POX染色およびNBT染色によりそれぞれ検出した。CD33の平均蛍光強度はフローサイトメトリーにより決定した。サバイビンのタンパク質レベルを調べるために免疫組織化学の方法を用いた。

METHODS: Human leukemic cell K562 was used as the model for the study. K562 cells were divided into 4 groups randomly: antisense oligonucleuotide (ASON) group, nonsense oligonucleotide (NSON) group, lipofectin group and control group. There were 5 samples in each group, and the experiment was repeated for three times. ASON was designed with the reference to targeting survivin mRNA. K562 cells were cultured in RPMI1640 contained fetal cattle serum at a concentration of about 10 percent. Cell transfection was induced by lipofectin. Forty-eight hours after thansfection, the morphology and ultrastructure were observed. Twenty-four hours and 48 hours after thansfection, the function of K562 cells was detected by benzidine staining, POX staining and NBT staining, respectively. The mean fluorescence intensity of CD33 was determined by flow cytometry. The method of immunohistochemistry was used to examine the protein level of survivin.

結果:

ASONを投与した後、K562細胞のサイズは小さくなったが、細胞質は増加した。また、メタルーブリサイト、セグメント顆粒球、アポトーシス細胞が認められた。形態学的、超構造学的には、赤血球、骨髄球の分化が認められた。ASON群のベンジジン染色の陽性レベル（24時間で11.90±2.30、48時間で18.20±2.93）は、それぞれNSON群、リポフェクチン群、対照群に比べて高かった。また、ASON群のPOX染色の陽性レベル（24時間で17.40±3.54、48時間で29.40±3.70）は、他のどの群よりも高かった。また、ASON群のNBT染色の陽性レベル（24時間で7.50 +/- 2.26、48時間で12.10 +/- 2.63）は、それぞれNSON群、リポフェクチン群、対照群と比較して有意に高かった（P < 0.01）。また、ASON群では、CD33の平均蛍光強度（24時間で21.43±1.61、48時間で14.86±1.20）が他のどの群よりも有意に低かった（P＜0.01）。24時間後にASON群のサバイビン蛋白質レベルは対照群と比較して有意に低下した。24時間後のサバイビン蛋白質レベルには、ASON群、NSON群、リポフェクチン群で差はなかった(P > 0.05)。トランスフェクション後48時間後には、サバイビン蛋白質レベルが有意に低下した。

RESULTS: After thansfection with ASON, the size of K562 cells was reduced, but the cytoplasm was increased. The metarubricyte, segment granulocyte, apoptotic cells could be found. Morphologically and ultrastructurally, erythroid and myelocytic differentiation was observed. The positive level of benzidine staining in ASON group (11.90 +/- 2.30 at 24 h and 18.20 +/- 2.93 at 48 h) was higher than that of NSON group, lipofectin group and control group, respectively. The positive level of POX staining in ASON group (17.40 +/- 3.54 at 24 h and 29.40 +/- 3.70 at 48 h) was also higher than that of any other groups. The positive level of NBT staining in ASON group (7.50 +/- 2.26 at 24 h and 12.10 +/- 2.63 at 48 h) was significantly higher than that of NSON group, lipofectin group and control group, respectively (P < 0.01). In ASON group, the mean fluorescence intensity of CD33 (21.43 +/- 1.61 at 24 h and 14.86 +/- 1.20 at 48 h) was significantly lower than that of any other groups (P < 0.01). After thansfection for 24 h, the protein level of survivin in ASON group was decreased significantly compared to that of control group. There was no difference in survivin protein level amongst ASON group, NSON group and lipofectin group at 24 h (P > 0.05). Forty-eight hours after thansfection, the protein level of survivin was decreased significantly.

結論:

サバイビンを標的としたASONは、K562の赤血球・骨髄球分化を誘導することができる。サバイビンはK562細胞の分化に関与しており、白血病の遺伝子治療のターゲットとなり得る。

CONCLUSIONS: ASON targeting survivin can induce K562 to erythroid and myelocytic differentiation. Survivin is related to differentiation of K562 cells, and it can be a target of gene therapy for leukemia.