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CaMKIIによる引張歪み誘発性Ets-2リン酸化と頭蓋縫合糸のホメオスタシス
Tensile strain-induced Ets-2 phosphorylation by CaMKII and the homeostasis of cranial sutures.
PMID: 19182667 DOI: 10.1097/PRS.0b013e318191c029.
抄録
背景:
メカノトランスダクションは、頭蓋縫合部を含む筋骨格系組織の恒常性を支えている。細胞内カルシウム、[Ca 2+]ic、およびタンパク質のリン酸化は、メカノトランスダクションの間のシグナル伝達における2つの中間変数である。このプロジェクトでは、細胞の歪みと基質のリン酸化をリンクさせ、因果関係の連鎖を確立し、リン酸化の薬剤と標的部位を特定します。
BACKGROUND: Mechanotransduction underpins the homeostasis of musculoskeletal tissues, including cranial sutures. Intracellular calcium, [Ca 2+]ic, and protein phosphorylation are two intermediate variables in signal relay during mechanotransduction. This project establishes a chain of cause and effect, linking cellular strain to substrate phosphorylation, and identifies the agent and target sites of phosphorylation.
方法:
1日齢ラット矢状縫合糸に周期的引張力（0.5N、1Hz）を加えた。Ca 2+]icはFURA-2を用いて測定した。CaMKIIによるEts-2リン酸化をウエスタンブロットオートラジオグラフィーを用いて試験した。ペプチドアレイを構築し、リン酸化の正確な部位を決定した。その結果は、ホスホ特異的抗体を用いた質量分析とウエスタンブロットで確認された。
METHODS: Cyclic tensile force (0.5 N at 1 Hz) was applied to 1-day-old rat sagittal sutures. [Ca 2+]ic was measured by FURA-2. Ets-2 phosphorylation by CaMKII was tested using Western blot autoradiography. Peptide array was constructed to determine the precise sites of phosphorylation. The results were confirmed with mass spectroscopy and Western blots using phospho-specific antibodies.
結果:
Ca2+]icは引張応力に応答して急激に増加した。Ca2+の存在下では、CaMKIIはEts-2のリン酸化を引き起こした。CaMKIIによるEts-2のリン酸化の3つの可能性のある部位のうち、RVPS、FESF、RLSS、セリン246、310、313が標的であった。さらに、連続した配列がこの効果を修飾した。質量分析法は、リン酸化と一致する８０Ｄａ（リン酸基の分子量、-ＰＯ３）の右シフトを示した。縫合細胞の引張変形には、Ets-2の細胞質転座があった。Ets-2のCaMKII結合は、引張ひずみの発生から30分以内に発生した。
RESULTS: [Ca 2+]ic increased rapidly in response to tensile stress. In the presence of Ca2+, CaMKII caused Ets-2 phosphorylation. Of the three possible sites for phosphorylation of Ets-2 by CaMKII, RVPS, FESF, RLSS, Serine 246, 310, and 313 were the targets. Furthermore, the contiguous sequence modified this effect. Mass spectroscopy showed 80 Da (molecular weight of phosphate group, -PO3) right shifts consistent with phosphorylation. There was cytosolic translocation of Ets-2 on tensile deformation of suture cells. CaMKII binding of Ets-2 occurred within 30 minutes after the onset of tensile strain.
結論:
頭蓋縫合細胞は、[Ca 2+]icを増加させることにより引張力に応答することができ、それによりCaMKIIがEts-2をリン酸化し、その下流のプロモーターへのEts-2の結合を変化させる。注目すべきことに、Ets-2は、頭蓋湾吻合において重要な3つの重要な経路、すなわち、線維芽細胞増殖因子-2、トランスフォーミング増殖因子-β、およびメカノトランスダクションの交差点に位置している。
CONCLUSIONS: Cranial suture cells can respond to tensile forces by increasing [Ca 2+]ic, which causes CaMKII to phosphorylate Ets-2, thus altering Ets-2 binding to its downstream promoters. Of note, Ets-2 is at the intersection of three key pathways important in craniosynostosis: fibroblast growth factor-2, transforming growth factor-beta, and mechanotransduction.