網膜虚血誘発性アポトーシスは、Bak および Bcl-2 の発現変化よりもむしろ Bax および Bcl-x(L) の発現変化と関連していることが明らかになった

Retinal ischemia-induced apoptosis is associated with alteration in Bax and Bcl-x(L) expression rather than modifications in Bak and Bcl-2.

• Nathalie Produit-Zengaffinen
• Constantin J Pournaras
• Daniel F Schorderet

抄録

目的:

アポトーシスは網膜虚血後の細胞死において重要な役割を果たすことが知られている。しかし、関与するシグナル伝達経路の動態や、このプロセスへの寄与についてはほとんど知られていない。本研究の目的は、ミトコンドリアのアポトーシス経路における分子の発現の変化が、虚血/再灌流後の網膜損傷の進行を説明できるかどうかを決定することであった。

PURPOSE: Apoptosis is known to play a key role in cell death after retinal ischemia. However, little is known about the kinetics of the signaling pathways involved and their contribution to this process. The aim of this study was to determine whether changes in the expression of molecules in the mitochondrial apoptotic pathway might explain the progression of retinal damage following ischemia/reperfusion.

方法:

網膜虚血は、硝子体腔内の眼圧を 150 mmHg まで 60 分間上昇させることで誘導した。再灌流後 0 時間後、3 時間後（初期）、24 時間後（後期）に網膜を採取し、Bax、Bak、Bcl-2、Bcl-x(L)、カスパーゼ-3、-7 の発現の変化を qPCR で、場合によってはウエスタンブロットで調べた。

METHODS: Retinal ischemia was induced by elevating intraocular pressure in the vitreous cavity to 150 mmHg for a period of 60 min. At time 0, 3 h (early phase), and 24 h (late phase) after reperfusion, the retinas were harvested and modifications in the expression of Bax, Bak, Bcl-2, and Bcl-x(L) as well as caspase-3 and -7, were examined by qPCR and, in some cases, by western blot.

結果:

虚血後の初期段階で実施したqPCR解析では、Bax、Bak、およびBcl-x(L)の時間依存的な減少が見られ、網膜虚血に応答してBcl-2 mRNA発現に変化は見られなかった。タンパク質レベルでは、プロアポトーシスBaxおよびBakは変調されなかったが、Bcl-2およびBcl-x(L)は有意にアップレギュレートされた。この段階では、Bcl-2あたりのBaxとBax:Bcl-x(L)の比率は変化しなかった。回復の後期段階では、BaxおよびBcl-x(L) mRNAはダウンレギュレートされたが、Bakは増加した。Bax:Bcl-2およびBax:Bcl-x(L)のmRNAおよびタンパク質レベルでの比の増加が虚血性インシュルトの24時間後に観察された。ミトコンドリアが媒介するアポトーシスに関連するカスパーゼを解析したところ、再灌流後24時間後の虚血網膜ではカスパーゼ3の発現が特異的に増加し、カスパーゼ7の発現は減少していた。

RESULTS: qPCR analysis performed at the early phase after ischemia revealed a time dependent decrease in Bax, Bak, and Bcl-x(L) and no alteration in Bcl-2 mRNA expression in response to retinal ischemia. At the protein level, proapoptotic Bax and Bak were not modulated while Bcl-2 and Bcl-x(L) were significantly upregulated. At this stage, the Bax per Bcl-2 and Bax:Bcl-x(L) ratios were not modified. At the late phase of recovery, Bax and Bcl-x(L) mRNAs were downregulated while Bak was increased. Increased Bax:Bcl-2 and Bax:Bcl-x(L) ratios at both the mRNA and protein levels were observed 24 h after the ischemic insult. Analysis of caspases associated with mitochondria-mediated apoptosis revealed a specific increase in the expression of caspase-3 in the ischemic retinas 24 h after reperfusion, and a decrease in the expression of caspase-7.

結論:

本研究では、Bcl-2関連のファミリーメンバーが虚血後の初期と後期で異なる制御を受けていることを明らかにした。我々は、Bax:Bcl-2とBax:Bcl-x(L)のバランスは初期段階では影響を受けなかったが、回復の後期段階ではBax:Bcl-x(L)の比率がアポトーシスの方向にシフトしていることを示した。このシフトは、カスパーゼ-３のアップレギュレーションによって強化された。

CONCLUSIONS: This study revealed that Bcl-2-related family members were differently regulated in the early and late phases after an ischemic insult. We showed that the Bax:Bcl-2 and Bax:Bcl-x(L) balances were not affected in the initial phases, but the Bax:Bcl-x(L) ratio shifted toward apoptosis during the late phase of recovery. This shift was reinforced by caspase-3 upregulation.