大腸菌由来ClC型塩化プロトンアンチポーターの電荷輸送機構

Charge transport in the ClC-type chloride-proton anti-porter from Escherichia coli.

• Gernot Kieseritzky
• Ernst-Walter Knapp

抄録

ClC塩化物チャネルのスーパーファミリーの中で最初に同定された塩化物トランスポーターは、大腸菌（EClC）であった（Accardi, A. and Miller, C. (2004) Nature 427, 803-807）。プロトンと塩化物の移動と結合の経路、エネルギー、メカニズムはこれまで明らかにされていませんでした。プロトン輸送の疎水性ギャップを埋めるために、WT EClC構造の両サブユニットに4つの安定な埋水をモデル化した。これらのサブユニットが一緒になって、Glu-203を中心部位の塩化物と接続する「水のワイヤー」を形成し、そのワイヤーはGlu-148（プロトンの出口部位）に接続した。EClCの中央の塩化物結合部位で塩酸塩が一過性に生成されると仮定すると、水線はGlu-203から下流のGlu-148に至るまでの膜貫通プロトン輸送経路を確立する可能性がある。私たちは、静電計算及び量子化学計算により、中央の塩化物のプロトン化がエネルギー的に可能であることを実証した。EClCのプロトン-塩化物輸送サイクルに関連する可能性のあるすべての塩化物占有率とプロトン化状態を特徴づけ、作業モデルを構築した。その結果、ECLCは最大で2個の過剰プロトンと1個から3個の塩化物を含む状態を経て進化することがわかった。EClCのY445F変異体とE203H変異体も同様の動作をすることを明らかにした。提案されたECLCにおける塩化物-陽子連成輸送のメカニズムは、利用可能な実験データと一致しており、特定のアミノ酸の重要性を予測することが可能である。

The first chloride transporter identified in the superfamily of ClC chloride channels was from Escherichia coli (EClC) (Accardi, A., and Miller, C. (2004) Nature 427, 803-807). Pathways, energetics, and mechanism of proton and chloride translocation and their coupling are up to now unclear. To bridge the hydrophobic gap of proton transport, we modeled four stable buried waters into both subunits of the WT EClC structure. Together they form a "water wire" connecting Glu-203 with the chloride at the central site, which in turn connects to Glu-148, the hypothetical proton exit site. Assuming the transient production of hydrochloride in the central chloride binding site of EClC, the water wire could establish a transmembrane proton transport pathway starting from Glu-203 all the way downstream onto Glu-148. We demonstrated by electrostatic and quantum chemical computations that protonation of the central chloride is energetically feasible. We characterized all chloride occupancies and protonation states possibly relevant for the proton-chloride transport cycle in EClC and constructed a working model. Accordingly, EClC evolves through states involving up to two excess protons and between one and three chlorides, which was required to fulfill the experimentally observed 2:1 stoichiometry. We show that the Y445F and E203H mutants of EClC can operate similarly, thus explaining why they exhibit almost WT activity levels. The proposed mechanism of coupled chloride-proton transport in EClC is consistent with available experimental data and allows predictions on the importance of specific amino acids, which may be probed by mutation experiments.