フェムトモルインヒビター-アセチルコリンエステラーゼ複合体の結晶状態での構造変化

Conformational remodeling of femtomolar inhibitor-acetylcholinesterase complexes in the crystalline state.

• Yves Bourne
• Zoran Radić
• Palmer Taylor
• Pascale Marchot

抄録

アセチルコリンエステラーゼ（AChE）の活性中心は、競合阻害剤の標的部位であり、芳香族残基が並ぶ深く狭い峡谷の基部にあるサブユニットに対して中心対称に存在する。峡谷の入口では、周辺部位が非競合的阻害剤の結合部位と重なり、基質の峡谷へのアクセスを変化させている。クリック化学阻害剤TZ2PA6は、活性中心リガンドであるタクリンと周辺部位リガンドであるプロピジウムを、アセチレンとアジドの二元交叉反応を介して連結させることで、Syn1またはanti1トリアゾールを形成している。野生型マウスAChEと比較して、Tyr337Ala変異体は完全な触媒活性を示したが、TZ2PA6のsyn1およびanti1レジオアイソマーに対する親和性は2〜3桁高いものの、低いフェムトモルK(d)値、拡散制限された会合、および解離半減期がそれぞれ1ヶ月と1週間以上であることが反映されている。共結晶化したTyr337Ala変異体のSyn1及びanti1複合体の3つの構造は、溶液中での複合体の半減期と一致するか、それ以上であったが、浸漬したTyr337Ala結晶から得られた結晶性複合体は、「できたばかりの」複合体の絵図を描くようになっていた。2.55-2.75Åの分解能で得られた構造は、野生型AChE複合体では観察されなかった、酵素峡谷内での側鎖の位置的な再配置に関連した、結合したレジオアイソマーの前例のないコンフォメーションの範囲を明らかにした。さらに、結晶性錯体の時間依存的なコンフォメーションのリモデリングは、溶液錯体の解離半減時間と相関しているようである。このことから、TZ2PA6阻害剤では、溶液中で運動論的に駆動された初期の複合体は、熱力学的平衡に支配されたより安定な複合体をゆっくりと形成し、成熟した結晶中で観察された。

The active center of acetylcholinesterase (AChE), a target site for competitive inhibitors, resides centrosymmetric to the subunit at the base of a deep, narrow gorge lined by aromatic residues. At the gorge entry, a peripheral site encompasses overlapping binding loci for noncompetitive inhibitors, which alter substrate access to the gorge. The click-chemistry inhibitor TZ2PA6 links the active center ligand, tacrine, to the peripheral site ligand, propidium, through a biorthogonal reaction of an acetylene and an azide that forms either a syn1 or an anti1 triazole. Compared with wild-type mouse AChE, a Tyr337Ala mutant displays full catalytic activity, albeit with 2-3 orders of magnitude higher affinities for the TZ2PA6 syn1 and anti1 regioisomers, reflected in low femtomolar K(d) values, diffusion-limited association, and dissociation half-times greater than 1 month and 1 week, respectively. Three structures of each of the co-crystallized syn1 and anti1 complexes of the Tyr337Ala mutant were solved at three distinct times of crystal maturation, consistent with or exceeding the half-lives of the complexes in solution, while crystalline complexes obtained from soaked Tyr337Ala crystals led to picturing "freshly formed" complexes. The structures, at 2.55-2.75 Å resolution, reveal a range of unprecedented conformations of the bound regioisomers, not observed in the wild-type AChE complexes, associated with concerted positional rearrangements of side chains in the enzyme gorge. Moreover, time-dependent conformational remodeling of the crystalline complexes appears to correlate with the dissociation half-times of the solution complexes. Hence, for the tight-binding TZ2PA6 inhibitors, the initial complexes kinetically driven in solution slowly form more stable complexes governed by thermodynamic equilibrium and observable in mature crystals.