OS-FRET：改良されたFRET測定のための新しいワンサンプル法

OS-FRET: a new one-sample method for improved FRET measurements.

• Annette H Erbse
• Adam J Berlinberg
• Ching-Ying Cheung
• Wai-Yee Leung
• Joseph J Falke

抄録

蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、生体内の高分子集合体を生理現象に近い条件で研究するための強力なツールである。ここでは、ジスルフィド結合を介してターゲットのスルフヒドリル残基に可逆的に結合することができる新規な非蛍光メタンスルホン酸結合アクセプターを採用した新しいタイプのワンサンプルFRET（OS-FRET）法を紹介します。消光したドナー発光を定量した後、アクセプターは還元により除去され、同じサンプル中の消光していないドナー発光を測定することができます。これまでのワンサンプル法では、特定のFRETアプリケーションにおいて明確な利点がありました。新しいOS-FRET法は、本質的なジスルフィド結合を欠いた高分子系に適用可能な一般化可能な分光化学的アプローチであり、従来のワンサンプル法に見られる潜在的な系統誤差を排除しています。さらに、OS-FRET法は、実質的にあらゆる蛍光分光器や検出器での定量的なFRET測定を可能にします。従来のマルチサンプルFRET法と比較して、OS-FRETはサンプルを保存し、データの精度を高め、1回の測定時間を短縮します。この方法の有用性は、Thermotoga maritima由来のCheWとCheAのP4-P5フラグメントによって形成された既知の構造を持つタンパク質複合体への応用によって示されている。これらの知見は、OS-FRETの実用性と利点を確認するものである。OS-FRETの応用としては、高分子の構造解析、結合・構造ダイナミクスの解析、相互作用や阻害剤のハイスループットスクリーニングなどが期待されます。

Fluorescence resonance energy transfer (FRET) is a powerful tool for studying macromolecular assemblies in vitro under near-physiological conditions. Here we present a new type of one-sample FRET (OS-FRET) method employing a novel, nonfluorescent methanethiosulfonate-linked acceptor that can be reversibly coupled to a target sulfhydryl residue via a disulfide bond. After the quenched donor emission is quantitated, the acceptor is removed by reduction, allowing measurement of unquenched donor emission in the same sample. Previous one-sample methods provide distinct advantages in specific FRET applications. The new OS-FRET method is a generalizable spectrochemical approach that can be applied to macromolecular systems lacking essential disulfide bonds and eliminates the potential systematic errors of some earlier one-sample methods. In addition, OS-FRET enables quantitative FRET measurements in virtually any fluorescence spectrometer or detection device. Compared to conventional multisample FRET methods, OS-FRET conserves sample, increases the precision of data, and shortens the time per measurement. The utility of the method is illustrated by its application to a protein complex of known structure formed by CheW and the P4-P5 fragment of CheA, both from Thermotoga maritima. The findings confirm the practicality and advantages of OS-FRET. Anticipated applications of OS-FRET include analysis of macromolecular structure, binding and conformational dynamics, and high-throughput screening for interactions and inhibitors.