網膜芽細胞腫遺伝子産物の高リン酸化は、シミアンウイルス４０のlarge-T-抗原結合領域の外側のドメインによって決定される

Hyperphosphorylation of the retinoblastoma gene product is determined by domains outside the simian virus 40 large-T-antigen-binding regions.

• P A Hamel
• B L Cohen
• L M Sorce
• B L Gallie
• R A Phillips

抄録

マウス網膜芽細胞腫（RB）cDNAを用いて、一連のRB変異体をCOS-1細胞で発現させ、pRB産物を、(i)ラージT抗原（ラージT）に結合する能力、(ii)リン酸化によって修飾される能力、および(iii)核内に局在する能力について評価した。ラージTへの結合に寄与すると以前に定義された領域に導入されたすべての点突然変異および欠失は、pRB-ラージT複合体の形成を廃止し、RBタンパク質の過リン酸化を防止した。対照的に、これらの部位への一連の5'欠失はラージTへの結合を妨げなかった。5'欠失変異体のいくつかは明らかに細胞周期に依存した方法でリン酸化されたが、1つ、delta PvuはラージTへの脱リン酸化結合に失敗した。N末端領域の3つのp34cdc2リン酸化部位に変異を加えたpRBは野生型pRBと同様の挙動を示したが、ラージT結合部位のC末端の4つのセリン残基に変異を加えたdelta P5-6-7-8は、ラージTに結合する能力を保持しているにもかかわらず、高リン酸化には至らなかった。これらの結果は、ラージTへの結合を担うpRBのドメインが、関連するpRB特異的キナーゼや細胞周期依存性のリン酸化部位を含むドメインとは異なることを示している。さらに、これらのデータは、pRBの細胞周期依存性リン酸化が他の細胞タンパク質との複合体形成を必要とするモデルと一致している。

With the murine retinoblastoma (RB) cDNA, a series of RB mutants were expressed in COS-1 cells and the pRB products were assessed for their ability (i) to bind to large T antigen (large T), (ii) to become modified by phosphorylation, and (iii) to localize in the nucleus. All point mutations and deletions introduced into regions previously defined as contributing to binding to large T abolished pRB-large T complex formation and prevented hyperphosphorylation of the RB protein. In contrast, a series of deletions 5' to these sites did not interfere with binding to large T. While some of the 5' deletion mutants were clearly phosphorylated in a cell cycle-dependent manner, one, delta Pvu, failed to be phosphorylated depsite binding to large T. pRB with mutations created at three putative p34cdc2 phosphorylation sites in the N-terminal region behaved similarly to wild-type pRB, whereas the construct delta P5-6-7-8, mutated at four serine residues C terminal to the large T-binding site, failed to become hyperphosphorylated despite retaining the ability to bind large T. All of the mutants described were also found to localize in the nucleus. These results demonstrate that the domains in pRB responsible for binding to large T are distinct from those recognized by the relevant pRB-specific kinase(s) and/or those which contain cell cycle-dependent phosphorylation sites. Furthermore, these data are consistent with a model in which cell cycle-dependent phosphorylation of pRB requires complex formation with other cellular proteins.