Clostridium perfringens 由来の新規アゾ還元酵素の同定、単離および特性解析

Identification, Isolation and characterization of a novel azoreductase from Clostridium perfringens.

抄録

アゾ染料は着色料として繊維、医薬品、化粧品および食品産業で広く使用されており、しばしば環境汚染の原因となっている。アゾ染料を還元する微生物には、アゾ還元酵素を利用できるものが多く存在する。アゾ染料のアゾ結合が還元されると、発がん性のある代謝物が生成され、人体への影響が懸念されています。アゾレダクターゼの研究分野は拡大していますが、厳密な嫌気性細菌由来のアゾレダクターゼに関する情報はほとんどありません。今回、ヒトの腸管内に多く存在する病原体であるClostridium perfringensからアゾレダクターゼ遺伝子を同定しました。C.perfringensは、特に一般的な染料であるDirect Blue 15の存在下で高いアゾレダクターゼ活性を示す。フラボタンパク質をコードする遺伝子を単離し、大腸菌で発現させ、さらに精製してアゾレダクターゼ活性を試験した。このアゾレダクターゼ（AzoCとして知られている）は、さまざまな色素を用いた酵素反応アッセイによって特徴づけられた。AzoC活性は、NADHとFADという2つの補酵素の存在下で最も高くなった。一部の色素では、AzoCの存在なし（補酵素のみ）で色素の還元が起こるため、強い補酵素効果が示された。AzoCは、pH9、室温、嫌気性環境で最高の性能を発揮することが示された。酵素動態の研究から、酵素と基質の結びつきが強いことが示唆された。以上の結果から、C.perfringens由来のAzoCはアゾレダクターゼ活性を有することが明らかとなった。

Azo dyes are used widely in the textile, pharmaceutical, cosmetic and food industries as colorants and are often sources of environmental pollution. There are many microorganisms that are able to reduce azo dyes by use of an azoreductase enzyme. It is through the reduction of the azo bonds of the dyes that carcinogenic metabolites are produced thereby a concern for human health. The field of research on azoreductases is growing, but there is very little information available on azoreductases from strict anaerobic bacteria. In this study, the azoreductase gene was identified in Clostridium perfringens, a pathogen that is commonly found in the human intestinal tract. C. perfringens shows high azoreductase activity, especially in the presence of the common dye Direct Blue 15. A gene that encodes for a flavoprotein was isolated and expressed in Escherichia coli, and further purified and tested for azoreductase activity. The azoreductase (known as AzoC) was characterized by enzymatic reaction assays using different dyes. AzoC activity was highest in the presence of two cofactors, NADH and FAD. A strong cofactor effect was shown with some dyes, as dye reduction occurred without the presence of the AzoC (cofactors alone). AzoC was shown to perform best at a pH of 9, at room temperature, and in an anaerobic environment. Enzyme kinetics studies suggested that the association between enzyme and substrate is strong. Our results show that AzoC from C. perfringens has azoreductase activity.