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大型一枚膜小胞を用いてBCL-2ファミリーの機能を調べる
Examining BCL-2 family function with large unilamellar vesicles.
PMID: 23070252 PMCID: PMC3490295. DOI: 10.3791/4291.
抄録
BCL-2(B細胞CLL/リンパ腫)ファミリーは、約20種類のタンパク質で構成されており、細胞の生存を維持したり、アポトーシスを開始したりするために協働しています(1)。細胞ストレス(例えば、DNA損傷)の後、プロアポトーシスを起こすBCL-2ファミリーエフェクターであるBAK(BCL-2アンタゴニスティックキラー1)やBAX(BCL-2 associated X protein)が活性化され、ミトコンドリア外膜透過化(MOMP)と呼ばれるプロセスを経て、ミトコンドリア外膜(OMM)の完全性が損なわれます(1)。MOMPが起こると、プロアポトーシスタンパク質(シトクロムcなど)が細胞質に侵入し、カスパーゼの活性化を促進し、アポトーシスが急速に進行します(2)。BAK/BAXがMOMPを誘導するためには、BID(BH3-interacting domain agonist)のようなBCL-2ファミリーの別のプロアポトーシスサブセット、BCL-2ホモロジードメイン3(BH3)のみのタンパク質との一過性の相互作用を必要とします(3-6)。抗アポトーシス性BCL-2ファミリータンパク質(BCL-2関連遺伝子、ロングアイソフォーム、BCL-xL;骨髄細胞白血病1、MCL-1など)は、BAK/BAXとBAK/BAXの活性化を直接誘導するBH3のみのタンパク質との相互作用を緊密に制御することで、細胞生存を制御している(7,8)。さらに、抗アポトーシス性BCL-2タンパク質の利用可能性は、BAD(細胞死のBCL-2アンタゴニスト)やPUMA(アポトーシスのp53 upregulated modulator)のような増感剤/脱抑制剤のBH3のみのタンパク質によっても決定され、これらは抗アポトーシスメンバーと結合して阻害されます(7,9)。抗アポトーシス性BCL-2レパートリーの大部分はOMMに局在しているため、生存を維持するかMOMPを誘発するかは、この膜における複数のBCL-2ファミリーの相互作用によって決定されます。大型一枚膜小胞(LUV)は、BCL-2ファミリーの相互作用と膜透過性の関係を探る生化学的モデルである(10)。LUVは、溶媒抽出されたキノープスのミトコンドリアの脂質組成研究で同定された比率(ホスファチジルコリン46.5%、ホスファチジルタノラミン28.5%、ホスファチジルイノシトール9%、ホスファチジルセリン9%、カルジオリピン7%)で組み立てられた定義された脂質で構成されています(10)。これは、タンパク質および脂質成分が完全に定義されており、一次ミトコンドリアでは必ずしもそうではないが、トラクタブルであるため、BCL-2ファミリーの機能を直接探索するのに便利なモデル系である。カーディオリピンは通常OMM全体でこれほど高くはないが、このモデルはBCL-2ファミリー機能を促進するためにOMMを忠実に模倣している。さらに、上記のプロトコルのより最近の修正は、ポリアニオン染料(ANTS:8-アミノナフタレン-1,3,6-トリスルホン酸)とカチオン性クエンチャー(DPX:臭化p-キシレン-ビス-ピリジニウム)を含むLUVに基づいて、タンパク質相互作用の速度論的解析と膜透過のリアルタイム測定を可能にします(11)。LUVが透過すると、ANTSとDPXが拡散し、蛍光の増加が検出される。ここでは、一般的に使用されている組換えBCL-2ファミリータンパク質の組み合わせと、ANTS/DPXを含むLUVを使用したコントロールを記載しています。
The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis(1). Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)(1). After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues(2). In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)(3-6). Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation(7,8). In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members(7,9). As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane. Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization(10). LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)(10). This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)(11). As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.