FRAPを用いた細菌細胞の生体内生化学：翻訳サイクルへの洞察

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Biophys. J..2012 Nov;103(9):1848-59. S0006-3495(12)01076-4. doi: 10.1016/j.bpj.2012.09.035.

FRAPを用いた細菌細胞の生体内生化学：翻訳サイクルへの洞察

In vivo biochemistry in bacterial cells using FRAP: insight into the translation cycle.

Paula Montero Llopis
Oleksii Sliusarenko
Jennifer Heinritz
Christine Jacobs-Wagner

PMID: 23199913 PMCID: PMC3491719. DOI: 10.1016/j.bpj.2012.09.035.

抄録

細胞内で発生する生化学的プロセスを完全に理解するためには、細胞成分の移動度や結合動態のインビボ測定が不可欠である。ここでは、生きた細菌のサイズが小さいにもかかわらず、生きた細菌の反応拡散過程の研究に簡単に実装することができるフォトブリーチングベースの方法をベースとした蛍光回収について説明します。我々は、この方法を適用して、生きたコーロバクター細胞内の50Sリボソームサブユニットの結合速度とマイクロメートルスケールの拡散特性を測定することによって、細菌の翻訳サイクルの様々な側面について、我々の知識の新しい、定量的な洞察を提供するために。この測定結果から、50Sサブユニットの70％が翻訳に関与しており、平均してマイクロメートルスケールでは限られた動きを示しており、翻訳中の転写物がほとんど混ざり合っていないことが明らかになった。また、翻訳開始時の50Sサブユニットの30S開始複合体への結合と翻訳完了時のmRNAからの放出の平均速度定数を抽出した。この結果から、50Sサブユニットが次の開始イベントに関与するまでのタンパク質合成の平均時間と50Sサブユニットの平均探索時間を推定した。さらに、我々の実験から、いわゆるフリーの50Sサブユニットは自由に拡散するのではなく、その移動速度が大幅に遅くなることが示唆された。

In vivo measurements of the mobility and binding kinetics of cellular components are essential to fully understand the biochemical processes occurring inside cells. Here, we describe a fluorescence recovery after photobleaching-based method that can be easily implemented to the study of reaction-diffusion processes in live bacteria despite their small size. We apply this method to provide new, to our knowledge, quantitative insight into multiple aspects of the bacterial translation cycle by measuring the binding kinetics and the micrometer-scale diffusive properties of the 50S ribosomal subunit in live Caulobacter cells. From our measurements, we infer that 70% of 50S subunits are engaged in translation and display, on average, limited motion on the micrometer scale, consistent with little mixing of transcripts undergoing translation. We also extract the average rate constants for the binding of 50S subunits to 30S initiation complexes during initiation and for their release from mRNAs when translation is completed. From this, we estimate the average time of protein synthesis and the average search time of 50S subunits before they engage in the next initiation event. Additionally, our experiments suggest that so-called free 50S subunits do not diffuse freely; instead their mobility is significantly slowed down, possibly through transient associations with mRNA.