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バキュロウイルス蛋白質発現系を用いた生きた昆虫細胞の蛋白質の高分解能異核多次元NMR
High-resolution heteronuclear multidimensional NMR of proteins in living insect cells using a baculovirus protein expression system.
PMID: 23327446 DOI: 10.1021/ja310928u.
抄録
最近の細胞内NMR技術の発展により、生きている真核細胞内のタンパク質を詳細に研究できるようになった。既存のプロトコルを補完し、応用範囲を広げるために、我々はsf9細胞/バキュロウイルスシステムを用いて細胞内NMRスペクトルを観測するための新しいアプローチを紹介する。sf9細胞で発現した4つのモデルタンパク質について、高分解能2次元(1)H-(15)N相関スペクトルを観測した。さらに、サンプルの寿命の短さと標識タンパク質のアバンダンスの低さを克服するために、非線形サンプリングを用いて、ストレプトコッカスタンパク質G B1ドメインの3次元トリプルレゾナンスNMRスペクトルをsf9細胞内で観測した。データは、定量的最大エントロピーアルゴリズムを用いて処理した。これらは第一原理的に割り当てられ、期待されるバックボーンNMR共鳴の約80％が得られた。よく分解されたNOEのクロスピークは、3D (15)N分離されたNOESYスペクトルで識別することができ、タンパク質のこのサイズの構造解析は、sf9細胞で実行可能であることを示唆しています。
Recent developments in in-cell NMR techniques have allowed us to study proteins in detail inside living eukaryotic cells. In order to complement the existing protocols, and to extend the range of possible applications, we introduce a novel approach for observing in-cell NMR spectra using the sf9 cell/baculovirus system. High-resolution 2D (1)H-(15)N correlation spectra were observed for four model proteins expressed in sf9 cells. Furthermore, 3D triple-resonance NMR spectra of the Streptococcus protein G B1 domain were observed in sf9 cells by using nonlinear sampling to overcome the short lifetime of the samples and the low abundance of the labeled protein. The data were processed with a quantitative maximum entropy algorithm. These were assigned ab initio, yielding approximately 80% of the expected backbone NMR resonances. Well-resolved NOE cross peaks could be identified in the 3D (15)N-separated NOESY spectrum, suggesting that structural analysis of this size of protein will be feasible in sf9 cells.