短期間の周期的な機械的ひずみは、in vitroでのヒト胚性幹細胞による三種のサプリメントによる骨形成と骨結節形成を促進する

Short periods of cyclic mechanical strain enhance triple-supplement directed osteogenesis and bone nodule formation by human embryonic stem cells in vitro.

• Mingming Li
• Xiaobing Li
• Murray C Meikle
• Intekhab Islam
• Tong Cao

抄録

ヒト胚性幹細胞(hESC)は、自己複製と多系統分化の両方の能力を持つユニークな細胞である。本研究の目的は、デキサメタゾン、アスコルビン酸、β-グリセロリン酸（三元補体）による骨形成と骨結節形成が、短時間の周期的な機械的緊張によって促進されるかどうかを決定することであった。コロニーを21日間培養し、対照群（伸張なし）と3つの治療群に分けた；これらの群は、以下の期間（7-13日目）、（15-21日目）、および（7-21日目）において、FlexercellストレインユニットにリンクされたBioFlexプレート中で、交互の日に60秒ごとに1時間、5秒（0.2ヘルツ）の間2％の面内変形を受けた。多数の骨結節が形成され、それはオステオカルシンおよびI型コラーゲンに対して陽性に染色された；さらに、細胞数および総コラーゲンのMTSアッセイは、コントロールおよび他の治療群と比較して、7-13日目のグループで有意な増加を示した。アリザリンレッド染色はさらに、周期的機械的延伸が、対照培養群および他の２つの実験群と比較して、７〜１３日目の間に結節の大きさおよびミネラル密度を有意に増加させることを示した。次に、７〜１３日目の治療群についてリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）マイクロアレイを行い、機械的応答性骨形成遺伝子を同定した。アップレギュレーションされた遺伝子には、転写因子RUNX2とSOX9、骨形態形成タンパク質BMP1、BMP4、BMP5、BMP6、形質転換成長因子βファミリーメンバーTGFB1、TGFB2、TGFB3、およびミネラル化に関与する3つの遺伝子-ALPL、BGLAP、およびVDRが含まれていた。以上のことから、本研究では、4 回の 1 時間周期の機械的ひずみがトリプルサプリメントと相乗的に作用して、培養 hESC の骨形成と骨結節形成を促進することが示された。このことは、in vitroでミネラル化した骨の三次元構造を工学的に構築する方法の開発が、骨芽細胞が新しい骨を合成するための安定した表面を提供し、同時に破骨細胞の活動によって吸収されることができる生体材料を生産することによって、骨質再生の代替的なアプローチを提供できる可能性を示唆している。

Human embryonic stem cells (hESCs) are uniquely endowed with a capacity for both self-renewal and multilineage differentiation. The aim of this investigation was to determine if short periods of cyclic mechanical strain enhanced dexamethasone, ascorbic acid, and β-glycerophosphate (triple-supplement)-induced osteogenesis and bone nodule formation by hESCs. Colonies were cultured for 21 days and divided into control (no stretch) and three treatment groups; these were subjected to in-plane deformation of 2% for 5 s (0.2 Hertz) every 60 s for 1 h on alternate days in BioFlex plates linked to a Flexercell strain unit over the following periods (day 7-13), (day 15-21), and (day 7-21). Numerous bone nodules were formed, which stained positively for osteocalcin and type I collagen; in addition, MTS assays for cell number as well as total collagen assays showed a significant increase in the day 7-13 group compared to controls and other treatment groups. Alizarin Red staining further showed that cyclic mechanical stretching significantly increased the nodule size and mineral density between days 7-13 compared to control cultures and the other two experimental groups. We then performed a real-time polymerase chain reaction (PCR) microarray on the day 7-13 treatment group to identify mechanoresponsive osteogenic genes. Upregulated genes included the transcription factors RUNX2 and SOX9, bone morphogenetic proteins BMP1, BMP4, BMP5, and BMP6, transforming growth factor-β family members TGFB1, TGFB2, and TGFB3, and three genes involved in mineralization-ALPL, BGLAP, and VDR. In conclusion, this investigation has demonstrated that four 1-h episodes of cyclic mechanical strain acted synergistically with triple supplement to enhance osteogenesis and bone nodule formation by cultured hESCs. This suggests the development of methods to engineer three-dimensional constructs of mineralized bone in vitro, could offer an alternative approach to osseous regeneration by producing a biomaterial capable of providing stable surfaces for osteoblasts to synthesize new bone, while at the same time able to be resorbed by an osteoclastic activity-in other words, one that can recapitulate the remodeling dynamics of a naturally occurring bone matrix.