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野生型マウスとCdk5-/-マウスの比較リン酸化プロテオミクスによる脳内新規Cdk5基質の探索
Searching for novel Cdk5 substrates in brain by comparative phosphoproteomics of wild type and Cdk5-/- mice.
PMID: 24658276 PMCID: PMC3962345. DOI: 10.1371/journal.pone.0090363.
抄録
タンパク質のリン酸化は、細胞内のいくつかの重要な機能を制御する最も一般的な翻訳後修飾です。サイクリン依存性キナーゼ5(Cdk5)は、神経系で主に活性化されているプロリン指向のセリン/スレオニンキナーゼです。Cdk5は、神経細胞の移動、細胞骨格ダイナミクス、軸索誘導、シナプス可塑性などの生物学的プロセスを制御しています。脳内のCdk5の新規基質を探索するために、リン酸化タンパク質に特異的に結合する固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（IMAC）を用いて、E18.5 Cdk5+/+およびCdk5-/-胚由来の全脳からリン酸化タンパク質を単離し、定量的なリン酸化プロテオミクス解析を行った。単離したリン酸化タンパク質を溶出し、同位体標識して相対定量および絶対定量（iTRAQ）と質量分析による同定を行った。その結果、Cdk5-/-脳でリン酸化が低下した40個のタンパク質を発見した。さらに、これらの低リン酸化タンパク質のうち、MARCKS (Myristoylated Alanine-Rich protein Kinase C substrate)とGrin1 (G protein regulated inducer of neurite outgrowth 1)の2つのタンパク質を同定した。MARCKSはニワトリ神経細胞でCdk5にリン酸化されることが知られていますが、Grin1はCdk5にリン酸化されることは報告されていません。これらのタンパク質を N2A 神経芽腫細胞株で p35 と一緒に過剰発現させたところ、Cdk5 モチーフのセリンリン酸化が増加していることがわかりました。対照的に、Cdk5 阻害剤であるロスコビチンで処理すると、MARCKS をトランスフェクションした N2A 細胞および海馬一次ニューロンでは、セリンのリン酸化に反対の効果が得られた。以上の結果から、Grin 1 は新規な Cdk5 基質として同定され、MARCKS は Cdk5 基質として同定されていることが確認された。
Protein phosphorylation is the most common post-translational modification that regulates several pivotal functions in cells. Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) is a proline-directed serine/threonine kinase which is mostly active in the nervous system. It regulates several biological processes such as neuronal migration, cytoskeletal dynamics, axonal guidance and synaptic plasticity among others. In search for novel substrates of Cdk5 in the brain we performed quantitative phosphoproteomics analysis, isolating phosphoproteins from whole brain derived from E18.5 Cdk5+/+ and Cdk5-/- embryos, using an Immobilized Metal-Ion Affinity Chromatography (IMAC), which specifically binds to phosphorylated proteins. The isolated phosphoproteins were eluted and isotopically labeled for relative and absolute quantitation (iTRAQ) and mass spectrometry identification. We found 40 proteins that showed decreased phosphorylation at Cdk5-/- brains. In addition, out of these 40 hypophosphorylated proteins we characterized two proteins, :MARCKS (Myristoylated Alanine-Rich protein Kinase C substrate) and Grin1 (G protein regulated inducer of neurite outgrowth 1). MARCKS is known to be phosphorylated by Cdk5 in chick neural cells while Grin1 has not been reported to be phosphorylated by Cdk5. When these proteins were overexpressed in N2A neuroblastoma cell line along with p35, serine phosphorylation in their Cdk5 motifs was found to be increased. In contrast, treatments with roscovitine, the Cdk5 inhibitor, resulted in an opposite effect on serine phosphorylation in N2A cells and primary hippocampal neurons transfected with MARCKS. In summary, the results presented here identify Grin 1 as novel Cdk5 substrate and confirm previously identified MARCKS as a a bona fide Cdk5 substrate.