16S rRNA遺伝子シークエンスを用いたう蝕象牙質病変部の微生物叢の同定

Identification of the microbiota in carious dentin lesions using 16S rRNA gene sequencing.

• Junko Obata
• Toru Takeshita
• Yukie Shibata
• Wataru Yamanaka
• Masako Unemori
• Akifumi Akamine
• Yoshihisa Yamashita

抄録

ヒトのう蝕の原因となる特定の病原体はミュータンスレンサ球菌であると長い間考えられてきたが，近年，複雑なう蝕関連微生物叢という概念が注目されている．分子解析により、う蝕象牙質病変ではLactobacillusとPrevotellaが優勢であり、微生物叢の複雑さが明らかになった。しかし、象牙質齲蝕関連微生物叢の特徴については、異なる民族や人種では広く検討されていない。本研究では，16S rRNA遺伝子を用いた分子生物学的アプローチにより，日本人の齲蝕象牙質内の細菌叢を包括的に解析した．4～76歳の被験者32名からむし歯のある象牙質を採取し，抽出したDNAからユニバーサルプライマーを用いて増幅した16S rRNA遺伝子をパイロシークエンサーで塩基配列を決定した。細菌組成は，Lactobacillusの相対的な存在度（高，中，低）に応じて，クラスターI，II，IIIに分類された。クラスターIIの細菌組成は、OlsenellaとPropionibacteriumの割合が相対的に高いか、異種の属が優勢であった。クラスターIIIの細菌群は，Atopobium，Prevotella，またはPropionibacteriumが優勢で，StreptococcusやActinomycesが含まれていたのが特徴である。クラスターIIおよびIIIの中には，AtopobiumとPropionibacteriumを中心としたサンプルがあり，むし歯性象牙質病変における新規の微生物群の組み合わせであり，日本人の特徴である可能性がある。クローンライブラリ解析の結果，Atopobium sp. HOT-416とP. acidifaciensは，日本人集団におけるこれらの属の中で歯牙齲蝕と関連する特異な種であることが明らかになった。次世代シークエンスを用いて日本人集団の歯牙う蝕病変の細菌組成をまとめたところ、AtopobiumやPropionibacteriumが優勢な典型的な日本人タイプであった。

While mutans streptococci have long been assumed to be the specific pathogen responsible for human dental caries, the concept of a complex dental caries-associated microbiota has received significant attention in recent years. Molecular analyses revealed the complexity of the microbiota with the predominance of Lactobacillus and Prevotella in carious dentine lesions. However, characterization of the dentin caries-associated microbiota has not been extensively explored in different ethnicities and races. In the present study, the bacterial communities in the carious dentin of Japanese subjects were analyzed comprehensively with molecular approaches using the16S rRNA gene. Carious dentin lesion samples were collected from 32 subjects aged 4-76 years, and the 16S rRNA genes, amplified from the extracted DNA with universal primers, were sequenced with a pyrosequencer. The bacterial composition was classified into clusters I, II, and III according to the relative abundance (high, middle, low) of Lactobacillus. The bacterial composition in cluster II was composed of relatively high proportions of Olsenella and Propionibacterium or subdominated by heterogeneous genera. The bacterial communities in cluster III were characterized by the predominance of Atopobium, Prevotella, or Propionibacterium with Streptococcus or Actinomyces. Some samples in clusters II and III, mainly related to Atopobium and Propionibacterium, were novel combinations of microbiota in carious dentin lesions and may be characteristic of the Japanese population. Clone library analysis revealed that Atopobium sp. HOT-416 and P. acidifaciens were specific species associated with dentinal caries among these genera in a Japanese population. We summarized the bacterial composition of dentinal carious lesions in a Japanese population using next-generation sequencing and found typical Japanese types with Atopobium or Propionibacterium predominating.