ガス透過性培養器を用いた培養細胞の間欠的低酸素曝露システム

System for exposing cultured cells to intermittent hypoxia utilizing gas permeable cultureware.

• Jan Polak
• Karen Studer-Rabeler
• Holly McHugh
• Mehboob A Hussain
• Larissa A Shimoda

抄録

組織間欠性低酸素（IH）は、閉塞性睡眠時無呼吸、鎌状赤血球貧血、身体運動や他の条件で発生します。ガスの溶解性が悪く、培地を介した拡散が遅いため、IHによるO(2)の転移をin vitroで模倣することができません。我々は、培養細胞のIHへの曝露を可能にするシステムを開発し、リアルタイムのO(2)測定と細胞応答によってそのような曝露を検証することを目指しました。標準的な24ウェル培養プレートとガス透過性フィルムから作られた底面を持つプレートを加熱キャビネットに配置しました。95% N(2) + 5% CO(2)または95% O(2) + 5% CO(2)の混合物をパージするために、プログラム可能なソレノイドを使用して、O(2)レベルの望ましい循環を誘導した。溶存酸素,ガス圧,温度,水の蒸発量をサイクル中に測定した。IH誘導細胞効果は、HEK296細胞における低酸素誘導因子(HIF)およびNF-κBルシフェラーゼレポーター、ラットインスリン腫細胞におけるインスリン分泌によって評価した。キャビネット内の酸素サイクリングは、ガス透過性ではなく、標準的な培養器ではなく、ウェルの底でO（2）の同一の変化に変換されました。IH暴露の24時間は、HIF（112％）、NF-κB（111％）およびインスリン分泌（44％）を増加させた。重要な環境因子を制御しながら、培養細胞の再現性と長時間のIH曝露を可能にするシステムを記載しています。

Tissue intermittent hypoxia (IH) occurs in obstructive sleep apnea, sickle cell anemia, physical exercise and other conditions. Poor gas solubility and slow diffusion through culture media hampers mimicking IH-induced transitions of O(2) in vitro. We aimed to develop a system enabling exposure of cultured cells to IH and to validate such exposure by real-time O(2) measurements and cellular responses. Standard 24-well culture plates and plates with bottoms made from a gas permeable film were placed in a heated cabinet. Desired cycling of O(2) levels was induced using programmable solenoids to purge mixtures of 95% N(2) + 5% CO(2) or 95% O(2) + 5% CO(2). Dissolved oxygen, gas pressure, temperature, and water evaporation were measured during cycling. IH-induced cellular effects were evaluated by hypoxia inducible factor (HIF) and NF-κB luciferase reporters in HEK296 cells and by insulin secretion in rat insulinoma cells. Oxygen cycling in the cabinet was translated into identical changes of O(2) at the well bottom in gas permeable, but not in standard cultureware. Twenty-four hours of IH exposure increased HIF (112%), NF-κB (111%) and insulin secretion (44%). Described system enables reproducible and prolonged IH exposure in cultured cells while controlling for important environmental factors.