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機能化されたPHB顆粒は、組換えバチルス・メガテリウムのコレステロールとアナログの効率的な側鎖切断のための基礎を提供します
Functionalized PHB granules provide the basis for the efficient side-chain cleavage of cholesterol and analogs in recombinant Bacillus megaterium.
PMID: 26215140 PMCID: PMC4517628. DOI: 10.1186/s12934-015-0300-y.
抄録
背景:
すべてのステロイドホルモンの前駆体であるコレステロールは、脊椎動物に最も多く存在するステロイドであり、非常に疎水性が高いため、水性微生物の生物変換には難しい基質となっています。本研究では、Bacillus megateriumをベースとした全細胞システムを開発し、このステロイドの側鎖切断を可能にし、その生物触媒作用の基礎となる生理的基盤を調べました。
BACKGROUND: Cholesterol, the precursor of all steroid hormones, is the most abundant steroid in vertebrates and exhibits highly hydrophobic properties, rendering it a difficult substrate for aqueous microbial biotransformations. In the present study, we developed a Bacillus megaterium based whole-cell system that allows the side-chain cleavage of this sterol and investigated the underlying physiological basis of the biocatalysis.
結果:
グラム陽性土壌細菌B. megateriumに必要な電子伝達タンパク質と組み合わせて、側鎖切断チトクロムP450であるCYP11A1を組換え的に発現させた。可溶化剤として2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンとキージャサポニンの混合物を用いることで、動物ステロールであるコレステロールと7-デヒドロコレステロール、植物ステロールであるβ-シトステロールを効率よくプレグネノロンまたは7-デヒドロプレグネノロンに変換することができた。蛍光顕微鏡分析の結果、コレステロールは炭素とエネルギー貯蔵を担うポリ(3-ヒドロキシ酪酸)体(PHB)に蓄積し、膜タンパク質CYP11A1とそのレドックスパートナーであるアドレノドキシン還元酵素(AdR)も同様に、それらの周囲のリン脂質/タンパク質単分子膜に局在していることが明らかになった。PHB産生ポリメラーゼサブユニットPhaCを持たない突然変異株では、コレステロールを貯蔵する能力が欠如しており、コレステロール転化率が大幅に低下したが、組換えタンパク質の発現には影響を与えなかった。
RESULTS: CYP11A1, the side-chain cleaving cytochrome P450, was recombinantly expressed in the Gram-positive soil bacterium B. megaterium combined with the required electron transfer proteins. By applying a mixture of 2-hydroxypropyl-β-cyclodextrin and Quillaja saponin as solubilizing agents, the zoosterols cholesterol and 7-dehydrocholesterol, as well as the phytosterol β-sitosterol could be efficiently converted to pregnenolone or 7-dehydropregnenolone. Fluorescence-microscopic analysis revealed that cholesterol accumulates in the carbon and energy storage-serving poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) bodies and that the membrane proteins CYP11A1 and its redox partner adrenodoxin reductase (AdR) are likewise localized to their surrounding phospholipid/protein monolayer. The capacity to store cholesterol was absent in a mutant strain devoid of the PHB-producing polymerase subunit PhaC, resulting in a drastically decreased cholesterol conversion rate, while no effect on the expression of the recombinant proteins could be observed.
結論:
我々は、ステロイドホルモンの前駆体であるコレステロールをプレグネノロンに大量に変換することが可能なB. megateriumをベースとした全細胞システムを構築した。この微生物のPHB顆粒は、タンパク質/リン脂質単分子膜で被覆されたバイオプラスチックの集合体であり、基質貯蔵庫としての役割を果たすことで、高い変換率に重要であることを実証した。この微生物システムは、多種多様な疾患の治療のための薬剤の最大のグループの一つを代表するステロイドホルモンの任意のタイプに豊富に利用可能なコレステロールの工業的変換のための道を開きます。
CONCLUSION: We established a whole-cell system based on B. megaterium, which enables the conversion of the steroid hormone precursor cholesterol to pregnenolone in substantial quantities. We demonstrate that the microorganism's PHB granules, aggregates of bioplastic coated with a protein/phospholipid monolayer, are crucial for the high conversion rate by serving as substrate storage. This microbial system opens the way for an industrial conversion of the abundantly available cholesterol to any type of steroid hormones, which represent one of the biggest groups of drugs for the treatment of a wide variety of diseases.