中枢神経系へのデリバリーを目的としたshRNAとmiRNAの設計

Design of shRNA and miRNA for Delivery to the CNS.

• Gabriela Toro Cabrera
• Christian Mueller

抄録

神経疾患は、中枢神経系（CNS）の様々な領域を標的とする傾向があり、そのため、麻痺、認知症、死に至ることがあります。神経変性疾患は、神経細胞に影響を与えることで他の疾患と区別されています。RNA干渉（RNAi）の発見により、科学者は、遺伝子増強による遺伝子治療ではなく、特定の遺伝子のサイレンシングに基づいた新しい治療法を設計することが可能になりました。ウイルスベクター媒介の遺伝子サイレンシングには、2種類の分子を使用することができます：短いヘアピンRNA（shRNA）とRNAi経路に入る能力を持つ人工マイクロRNA（miRNA）です。shRNAとmiRNAの両方が遺伝子をサイレンシングするために使用することができますが、それらは異なるポイントでRNAi経路に入ります。shRNAとは異なり、miRNAは細胞質に輸出される前に核内で追加の切断ステップを必要とする。これらの分子は、その後、RNA誘導サイレンシング複合体（RISC）に組み込まれ、配列の相補性を利用して標的mRNAを認識し、部分的な相補性の場合は翻訳抑制を、完全な相補性の場合はmRNA切断を誘導する。強力なポリメラーゼIIIプロモーターによって一般的に駆動されるshRNAの量が増加すると、内因性分子と人工分子との間の競争のために、内因性RNAi機械の飽和を引き起こす可能性がある。DNAポリメラーゼIIプロモーターへの切り替えは、shRNAの産生を減少させ、それによって毒性を減少させるための代替手段である。分子が特定の mRNA を標的とするように設計されていても、非特異的な結合に起因するオフターゲット効果がある場合があり、設計プロセス中に考慮しなければなりません。この章では、shRNA と人工 miRNA の設計と in vitro スクリーニングについて説明します。

Neurologic diseases tend to target various areas of the central nervous system (CNS) and can therefore result in paralysis, dementia, and death. Neurodegenerative diseases distinguish themselves from other diseases by affecting nerve cells, which unlike many other cells in our body cannot regenerate when severely injured. The discovery of RNA interference (RNAi) has enabled scientist to design new therapeutic approaches based on specific gene silencing rather than the canonical gene therapy through gene augmentation. Two types of molecules can be used for viral vector-mediated gene silencing: short hairpin RNAs (shRNAs) and artificial microRNAs (miRNAs) that have the ability to enter the RNAi pathway. Although both shRNAs and miRNAs can be used to silence genes, they enter the RNAi pathway at different points. Unlike shRNAs, miRNAs require an additional cleavage step inside the nucleus before being exported to the cytoplasm. These molecules can then be incorporated into the RNA-induced silencing complex (RISC) which utilizes sequence complementarity to recognize target mRNAs and activate either translational repression, in the case of partial complementarity, or induce mRNA cleavage in the case of complete complementarity. Elevated amounts of shRNAs, which are commonly driven by strong polymerase III promoters, can cause saturation of the endogenous RNAi machinery due to competition between endogenous and artificial molecules. Switching to a DNA polymerase II promoter is an alternative to reduce shRNA production, thereby reducing toxicity. Even though the molecules are designed to target specific mRNAs there may be off-target effects due to nonspecific binding that must be accounted for during the design process. In this chapter we discuss the design and in vitro screening of shRNAs and artificial miRNAs.