ヘモグロビン化細胞中のヘムの迅速かつ高感度な定量

Rapid and sensitive quantitation of heme in hemoglobinized cells.

• Jason R Marcero
• Robert B Piel Iii
• Joseph S Burch
• Harry A Dailey

抄録

細胞内のヘムタンパク質が代謝に果たす重要な役割が明らかになりつつあり、研究室での迅速かつ正確なヘム定量がますます望まれるようになってきています。ここでは、ピリジンヘモクロモゲンおよび蛍光ヘムアッセイの伝統的なアプローチを、CLARiTY分光光度計を使用した直接吸光度ベースの技術と比較しています。これらの方法で試験したすべてのサンプルは、緩衝化ヘモグロビン標準物質、マウスからの全血、およびマウス赤血病（MEL）およびK562細胞を含む、ヘモグロビン関連ヘムが豊富に含まれていた。ピリジンヘモクロモゲンアッセイはヘム検出の最大の直線的な範囲を示したが、3つの方法はすべて同様の分析感度と標準化された定量限界は∼1 µMであった。驚くべきことに、蛍光アッセイは、非常に小さなサンプルを定量する能力においてのみ明確に示されました。ピリジンヘモクロモゲンおよび細胞数データと組み合わせてCLARiTYシステムを使用して、0.46 µM-1 cm-1の血液および分化MELおよびK562細胞のための共通のヘモグロビン消滅係数が導出されました。この値は、以前にヘム生合成に影響を与えることが示された因子（例えば、L-グルタミン、鉄）の添加または除去に応答して、MEL細胞のヘモグロビン化を測定するように設計された補足的な実験に適用された。

Rapid and accurate heme quantitation in the research lab has become more desirable as the crucial role that intracellular hemoproteins play in metabolism continues to emerge. Here, the time-honored approaches of pyridine hemochromogen and fluorescence heme assays are compared with direct absorbance-based technologies using the CLARiTY spectrophotometer. All samples tested with these methods were rich in hemoglobin-associated heme, including buffered hemoglobin standards, whole blood from mice, and murine erythroleukemia (MEL) and K562 cells. While the pyridine hemochromogen assay demonstrated the greatest linear range of heme detection, all 3 methods demonstrated similar analytical sensitivities and normalized limits of quantitation of ∼1 µM. Surprisingly, the fluorescence assay was only shown to be distinct in its ability to quantitate extremely small samples. Using the CLARiTY system in combination with pyridine hemochromogen and cell count data, a common hemoglobin extinction coefficient for blood and differentiating MEL and K562 cells of 0.46 µM-1 cm-1 was derived. This value was applied to supplemental experiments designed to measure MEL cell hemoglobinization in response to the addition or removal of factors previously shown to affect heme biosynthesis (e.g., L-glutamine, iron).