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Pmp22変異型対立遺伝子特異的siRNAは、生体内での脱髄性神経障害表現型を緩和する
Pmp22 mutant allele-specific siRNA alleviates demyelinating neuropathic phenotype in vivo.
PMID: 28108290 DOI: 10.1016/j.nbd.2017.01.006.
抄録
シャルコー・マリー・トゥース病（CMT）は、80以上の遺伝子の異常によって引き起こされる遺伝性疾患です。CMTは常染色体優性、常染色体劣性、Xリンク優性、Xリンク劣性などの不均一な遺伝様式を持っています。症例の95％以上は優性遺伝である。本研究では、対立遺伝子特異的small interfering RNA（siRNA）による突然変異対立遺伝子の制御が、CMTの脱髄性神経障害表現型を緩和できるかどうかを調べた。我々は、Pmp22の自然発生変異（Leu16Pro）を持つTrembler J（Tr-J）マウスを対象に、19種類の異なる対立遺伝子特異的siRNAをデザインした。ルシフェラーゼアッセイを用いて、変異対立遺伝子の発現レベルを特異的かつ選択的に低下させ、インビトロでの変異Pmp22の過剰発現に起因するシュワン細胞の低生存率を逆転させるsiRNAを同定した。アレル特異的siRNAのin vivoでの有効性は、Tr-Jマウスの生後6日目に腹腔内注射することで評価した。アレル特異的siRNAをTr-Jマウスに投与することで、運動機能および筋量が有意に増加し、ロータロッド試験および磁気共鳴画像解析により評価された。また、運動神経伝導速度および複合筋活動電位の増加も観察された。さらに、トルイジンブルー染色および電子顕微鏡検査で明らかになった骨髄化は、対立遺伝子特異的siRNA処理後のマウスの坐骨神経において増強された。また、Tr-Jマウスのシュワン細胞におけるPmp22変異体のmRNAレベルでの抑制を検証したところ、ミエリン塩基性蛋白質やミエリン蛋白質ゼロなどの骨髄化蛋白質の発現レベルが増加していることが確認された。これらのデータは、非ウイルス性siRNAの送達によるPmp22変異対立遺伝子の選択的な抑制が、in vivoでのCMTの脱髄性神経障害表現型を緩和することを示しており、対立遺伝子特異的siRNA治療が優性遺伝性の末梢神経障害に対する強力な治療戦略であることを示唆している。
Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) is a genetic disorder that can be caused by aberrations in >80 genes. CMT has heterogeneous modes of inheritance, including autosomal dominant, autosomal recessive, X-linked dominant, and X-linked recessive. Over 95% of cases are dominantly inherited. In this study, we investigated whether regulation of a mutant allele by an allele-specific small interfering RNA (siRNA) can alleviate the demyelinating neuropathic phenotype of CMT. We designed 19 different allele-specific siRNAs for Trembler J (Tr-J) mice harboring a naturally occurring mutation (Leu16Pro) in Pmp22. Using a luciferase assay, we identified an siRNA that specifically and selectively reduced the expression level of the mutant allele and reversed the low viability of Schwann cells caused by mutant Pmp22 over-expression in vitro. The in vivo efficacy of the allele-specific siRNA was assessed by its intraperitoneal injection to postnatal day 6 of Tr-J mice. Administration of the allele-specific siRNA to Tr-J mice significantly enhanced motor function and muscle volume, as assessed by the rotarod test and magnetic resonance imaging analysis, respectively. Increases in motor nerve conduction velocity and compound muscle action potentials were also observed in the treated mice. In addition, myelination, as evidenced by toluidine blue staining and electron microscopy, was augmented in the sciatic nerves of the mice after allele-specific siRNA treatment. After validating suppression of the Pmp22 mutant allele at the mRNA level in the Schwann cells of Tr-J mice, we observed increased expression levels of myelinating proteins such as myelin basic protein and myelin protein zero. These data indicate that selective suppression of the Pmp22 mutant allele by non-viral delivery of siRNA alleviates the demyelinating neuropathic phenotypes of CMT in vivo, implicating allele-specific siRNA treatment as a potent therapeutic strategy for dominantly inherited peripheral neuropathies.
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