SYBRグリーンベースのqRT-PCRを用いたアルゴヌートタンパク質との共免疫沈降によるmiRNAの定量化

Quantification of miRNAs Co-Immunoprecipitated with Argonaute Proteins Using SYBR Green-Based qRT-PCR.

• Hong-Duc Phan
• Junan Li
• Ming Poi
• Kotaro Nakanishi

抄録

マイクロRNA（miRNA）は、転写後の遺伝子サイレンシングの引き金となる小さなノンコーディングRNAである。これらのRNAは、機能的に機能するためにはArgonauteタンパク質と結合する必要があります。このアセンブリは、miRNAデュプレックスをロードすることから始まり、その後、ストランドの1本（パッセンジャー）が排出されます。残りの鎖（ガイド）は、Argonauteタンパク質と一緒にリボ核タンパク質エフェクター複合体（RNA-induced silencing complex, RISC）を形成する。Argonauteタンパク質の変異は、RISCアセンブリのいずれかのステップに影響を与える場合、miRNAの機能に影響を与えます。したがって、変異体のmiRNAレベルの低下を観察することは、Argonauteタンパク質の機械的機能におけるそれらのアミノ酸残基の役割についての洞察を提供するだろう。本章では、HEK293T 細胞から野生型および変異型のアルゴヌートタンパク質と共免疫沈降した特定の miRNA を、リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）を用いて相対的に定量する方法を紹介する。合成外因性miRNAを内部コントロールとしてcDNA合成前のRNA抽出でスパイクすることで、qRT-PCRアッセイから得られたC値を正規化し、Argonaute結合miRNAの相対的なレベルを定量することが可能になります。

MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that trigger post-transcriptional gene silencing. These RNAs need to be associated with the Argonaute proteins to be functional. This assembly begins with loading of a miRNA duplex, followed by the ejection of one of the strands (passenger). The remaining strand (guide) together with the Argonaute protein forms a ribonucleoprotein effector complex (the RNA-induced silencing complex, RISC). Mutation on the Argonaute protein, if affecting either step of the RISC assembly, impacts the function of miRNAs. Therefore, any observation of decreased miRNA level of mutants will provide insights into the role of those amino acid residues in the mechanical function of the Argonaute protein. In this chapter, we introduce a method to relatively quantify a specific miRNA co-immunoprecipitated with wild type and mutant Argonaute proteins from HEK293T cells, using Real-Time Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Spiking a synthetic exogenous miRNA as an internal control with RNA extraction prior to cDNA synthesis will normalize the C values obtained from the qRT-PCR assays and enable us to quantify the relative level of Argonaute-bound miRNA.