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依存性受容体UNC5Aは、乳がんの腔内から基底部への可塑性と転移を制限する
Dependence receptor UNC5A restricts luminal to basal breast cancer plasticity and metastasis.
PMID: 29720215 PMCID: PMC5932758. DOI: 10.1186/s13058-018-0963-5.
抄録
背景:
エストロゲン受容体陽性（ERα）乳癌の大部分は内分泌療法に反応します。しかし、内分泌療法に対する抵抗性は30％の症例で見られ、これはERαシグナル伝達の変化や、乳がんのサブタイプ転換につながるがん細胞の可塑性の亢進に起因している可能性があります。ERα陽性癌細胞の可塑性亢進のメカニズムは不明です。
BACKGROUND: The majority of estrogen receptor-positive (ERα) breast cancers respond to endocrine therapies. However, resistance to endocrine therapies is common in 30% of cases, which may be due to altered ERα signaling and/or enhanced plasticity of cancer cells leading to breast cancer subtype conversion. The mechanisms leading to enhanced plasticity of ERα-positive cancer cells are unknown.
方法:
遺伝学的には、ERα MCF7 細胞株および T-47D 細胞株において、依存性受容体 UNC5A の発現をノックダウンするために、ショートヘアピン(sh)RNA および CRISPR/Cas9 システムを用いた。UNC5Aノックダウンの基底およびエストラジオール（E2）制御遺伝子発現への影響を測定するために、RNA-seq、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、クロマチン免疫沈降およびウェスタンブロッティングを使用した。マムスフィアアッセイ、フローサイトメトリー、免疫蛍光法を用いて、可塑性を制限するUNC5Aの役割を決定した。UNC5Aのノックダウンが腫瘍の成長と転移に及ぼす影響を測定するために、ゼノグラフトモデルを用いた。組織マイクロアレイと免疫組織化学を用いて、乳癌におけるUNC5Aの予後を決定した。統計解析には、ログランク検定、一方向および二方向分散分析（ANOVA）を用いた。
METHODS: We used short hairpin (sh)RNA and/or the CRISPR/Cas9 system to knockdown the expression of the dependence receptor UNC5A in ERα MCF7 and T-47D cell lines. RNA-seq, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, chromatin immunoprecipitation, and Western blotting were used to measure the effect of UNC5A knockdown on basal and estradiol (E2)-regulated gene expression. Mammosphere assay, flow cytometry, and immunofluorescence were used to determine the role of UNC5A in restricting plasticity. Xenograft models were used to measure the effect of UNC5A knockdown on tumor growth and metastasis. Tissue microarray and immunohistochemistry were utilized to determine the prognostic value of UNC5A in breast cancer. Log-rank test, one-way, and two-way analysis of variance (ANOVA) were used for statistical analyses.
結果:
E2誘導性UNC5Aのノックダウンは、ERαのリガンド非依存性活性、リン酸化されたERαのターンオーバーの変化、ヒストン脱メチル化酵素活性に影響を与える遺伝子のE2依存性発現、BCL2などのE2誘導性遺伝子のアップレギュレーションの亢進、多臓器転移を伴うE2非依存性の腫瘍形成から明らかなように、細胞膜の完全性とERαシグナル伝達に影響を与える基底部遺伝子の発現の変化をもたらした。UNC5A枯渇は、基底/幹細胞濃縮∆Np63、CD44、CD49f、上皮成長因子受容体（EGFR）、リンパ管透過性因子NTN4の発現上昇によって支持される基底/基底ハイブリッド表現型の出現をもたらしたが、機能的なERαを維持しながら、基底/肺胞分化に関連するELF5の発現は低下していた。さらに、UNC5A欠損細胞は、KRT14/KRT19とCD49f/EpCAMの表現型に基づいて、腔内前駆細胞としての二分化能を獲得した。in vitroでの結果と一致し、乳房腫瘍ではUNC5Aの発現はEGFRの発現と負の相関があり、特にERα/PR/HER2腫瘍ではUNC5Aの発現低下は予後不良と関連していた。
RESULTS: Knockdown of the E2-inducible UNC5A resulted in altered basal gene expression affecting plasma membrane integrity and ERα signaling, as evident from ligand-independent activity of ERα, altered turnover of phosphorylated ERα, unique E2-dependent expression of genes effecting histone demethylase activity, enhanced upregulation of E2-inducible genes such as BCL2, and E2-independent tumorigenesis accompanied by multiorgan metastases. UNC5A depletion led to the appearance of a luminal/basal hybrid phenotype supported by elevated expression of basal/stem cell-enriched ∆Np63, CD44, CD49f, epidermal growth factor receptor (EGFR), and the lymphatic vessel permeability factor NTN4, but lower expression of luminal/alveolar differentiation-associated ELF5 while maintaining functional ERα. In addition, UNC5A-depleted cells acquired bipotent luminal progenitor characteristics based on KRT14/KRT19 and CD49f/EpCAM phenotype. Consistent with in vitro results, UNC5A expression negatively correlated with EGFR expression in breast tumors, and lower expression of UNC5A, particularly in ERα/PR/HER2 tumors, was associated with poor outcome.
結論:
これらの研究から、軸索誘導受容体であるUNC5Aが、ホルモン感受性乳癌のERαおよびEGFRシグナル伝達や腔内前駆細胞の状態を微調整する上で、予想外の役割を果たしていることが明らかになった。さらに、UNC5Aノックダウン細胞は、ERα乳癌の転移を調べるための理想的なモデル系となります。
CONCLUSION: These studies reveal an unexpected role of the axon guidance receptor UNC5A in fine-tuning ERα and EGFR signaling and the luminal progenitor status of hormone-sensitive breast cancers. Furthermore, UNC5A knockdown cells provide an ideal model system to investigate metastasis of ERα breast cancers.