リポ多糖（LPS）結合タンパク質は、CD14依存性Toll様受容体4の内部化とLPS誘導TBK1-IKKϵ-IRF3軸の活性化を刺激する

Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein stimulates CD14-dependent Toll-like receptor 4 internalization and LPS-induced TBK1-IKKϵ-IRF3 axis activation.

• Hiroki Tsukamoto
• Shino Takeuchi
• Kanae Kubota
• Yohei Kobayashi
• Sao Kozakai
• Ippo Ukai
• Ayumi Shichiku
• Misaki Okubo
• Muneo Numasaki
• Yoshitomi Kanemitsu
• Yotaro Matsumoto
• Tomonori Nochi
• Kouichi Watanabe
• Hisashi Aso
• Yoshihisa Tomioka

抄録

Toll-like receptor 4（TLR4）は、グラム陰性細菌の細胞壁の主要な構成要素であるリポ多糖類（LPS）に不可欠な免疫受容体である。LPS刺激後、TLR4は細胞表面からシグナルを伝達し、エンドソームに内包されます。しかし、TLR4シグナル伝達の空間的な制御については十分には解明されていない。ここでは、LPSによるTLR4の内部化のメカニズムを調べ、細胞外LPS結合分子であるLPS結合タンパク質（LBP）とグリセロホスファチジルイノシトール鎖タンパク質（CD14）の役割を明らかにしました。CD14発現細胞のLPS刺激は血清存在下でTLR4の内部化を誘導し、阻害性抗LBP mAbはその内部化をブロックした。血清を含まない培養物にLBPを添加すると、LPSによって誘導されたTLR4の内部化は、同程度の血清レベルにまで回復した。CD14（sCD14）の分泌型は内部化を誘導したが、LBPよりもはるかに高い濃度を必要とした。阻害性の抗sCD14 mAbは、血清を介した内部化には効果がなかった。LPSのCD14への移行ドメインを欠いたLBPと、LPSの結合が低下したCD14変異体は、両方ともTLR4の内部化を減衰させた。したがって、LBPはTLR4の内部化に不可欠な血清分子であり、LPSが膜貫通型CD14（mCD14）に移行することが必須条件であることが明らかになった。LBPは、LPS刺激によるTBK1, IKKϵ, IRF3のリン酸化を誘導し、IFN-βの発現を誘導した。しかし、LPS刺激によるNF-κBの晩期活性化や壊死には影響を与えなかった。以上の結果から、LBPはLPSによるTLR4の内部化を制御し、TLRアダプター分子1(TRIF)に依存してTBK1-IKKϵ-IRF3-IFN-β経路の活性化を誘導していることが明らかになった。以上のことから、LBPを介したLPSのmCD14への移行は、血清依存的なTLR4の内部化とTRIF経路の活性化に必要であることが明らかになった。

Toll-like receptor 4 (TLR4) is an indispensable immune receptor for lipopolysaccharide (LPS), a major component of the Gram-negative bacterial cell wall. Following LPS stimulation, TLR4 transmits the signal from the cell surface and becomes internalized in an endosome. However, the spatial regulation of TLR4 signaling is not fully understood. Here, we investigated the mechanisms of LPS-induced TLR4 internalization and clarified the roles of the extracellular LPS-binding molecules, LPS-binding protein (LBP), and glycerophosphatidylinositol-anchored protein (CD14). LPS stimulation of CD14-expressing cells induced TLR4 internalization in the presence of serum, and an inhibitory anti-LBP mAb blocked its internalization. Addition of LBP to serum-free cultures restored LPS-induced TLR4 internalization to comparable levels of serum. The secretory form of the CD14 (sCD14) induced internalization but required a much higher concentration than LBP. An inhibitory anti-sCD14 mAb was ineffective for serum-mediated internalization. LBP lacking the domain for LPS transfer to CD14 and a CD14 mutant with reduced LPS binding both attenuated TLR4 internalization. Accordingly, LBP is an essential serum molecule for TLR4 internalization, and its LPS transfer to membrane-anchored CD14 (mCD14) is a prerequisite. LBP induced the LPS-stimulated phosphorylation of TBK1, IKKϵ, and IRF3, leading to IFN-β expression. However, LPS-stimulated late activation of NF-κB or necroptosis were not affected. Collectively, our results indicate that LBP controls LPS-induced TLR4 internalization, which induces TLR adaptor molecule 1 (TRIF)-dependent activation of the TBK1-IKKϵ-IRF3-IFN-β pathway. In summary, we showed that LBP-mediated LPS transfer to mCD14 is required for serum-dependent TLR4 internalization and activation of the TRIF pathway.

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