ヒラメ（Paralichthys olivaceus）のストレプトコッカス・インフルエンザ感染症に対するワクチン候補としての免疫原性タンパク質の同定と組換えPDHA1とGAPDHの評価

Identification of immunogenic proteins and evaluation of recombinant PDHA1 and GAPDH as potential vaccine candidates against Streptococcus iniae infection in flounder (Paralichthys olivaceus).

• Xiuzhen Sheng
• Min Liu
• Haibo Liu
• Xiaoqian Tang
• Jing Xing
• Wenbin Zhan

抄録

グラム陽性病原体であるストレプトコッカス・インニアエは、世界中の魚類に侵襲的な病気を引き起こす主要な病原体であり、その免疫原性を明らかにするために、ヒラメの抗S.本研究では、S. iniae に対する有効性の高いワクチン開発のための免疫原性タンパク質を同定するために、ヒラメの抗 S. iniae 抗体を用いて S. iniae の全細胞溶解物タンパク質をウエスタンブロット法で解析し、分子量 37 kDa と 40 kDa の 2 つの陽性タンパク質バンドをスクリーニングした。iniae 抗体を用いたウエスタンブロット法で解析した結果、分子量37 kDaと40 kDaの2つの陽性蛋白質バンドをスクリーニングし、ピルビン酸脱水素酵素E1サブユニットアルファ（PDHA1）と同定した。BMPファミリーABCトランスポーター基質結合タンパク質（BMP）とL-乳酸脱水素酵素（LDH）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（OCT）、乳酸オキシダス（LOx）、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）を質量分析法で測定した。その結果，生きたヒラメを腹腔内投与した場合の相対生存率（RPS）は，それぞれ72.73％，27.27％，36.36％，9.09％，36.36％，63.64％であり，rPDHA1とrGAPDHはホルマリン処理したヒラメよりも高い相対生存率（36.36％）を示していた。さらに、rPDHA1およびrGAPDHの保護効果を調べるために、末梢血白血球中の表面膜免疫グロブリン陽性（sIg+）リンパ球の増殖、血清総IgM、S. iniaeに対する特異的IgMおよびRPSを検出した。その結果、rPDHA1、rGAPDH、ホルマリン処理したS. iniaeは対照群に比べてsIg+リンパ球の増殖、総血清IgMおよび特異的IgMの産生を有意に誘導し、rGAPDHおよびrPDHA1は再び高いRPS（それぞれ62.5％および75％）を提供することが示された。以上の結果から，rPDHA1とrGAPDHはヒラメのS. iniae感染症に対する有望なワクチン候補であることが示された。

Streptococcus iniae is a major Gram-positive pathogen that causes invasive disease in fish worldwide. In this study, in order to identify immunogenic proteins for developing highly effective vaccine against S. iniae, whole-cell lysate proteins of S. iniae were analyzed by western blotting using flounder anti-S. iniae antibodies, and two positive protein bands of molecular weight 37 kDa and 40 kDa were screened, which were identified as pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha (PDHA1), BMP family ABC transporter substrate-binding protein (BMP) and L-lactate dehydrogenase (LDH), as well as ornithine carbamoyltransferase (OCT), lactate oxidas (LOx) and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) by mass spectrometry. Subsequently, the six recombinant proteins were produced and used to immunize healthy flounder, and the relative percent survival (RPS) value was 72.73%, 27.27%, 36.36%, 9.09%, 36.36% and 63.64% respectively after intraperitoneal challenge with live S. iniae, revealing that rPDHA1 and rGAPDH produced higher relative percent survival than formalin-killed S. iniae (36.36%). To further investigate the protective efficacy of rPDHA1 and rGAPDH, the proliferation of surface membrane immunoglobulin-positive (sIg+) lymphocytes in peripheral blood leucocytes, the total serum IgM, specific IgM against S. iniae and RPS were detected. The results showed that rPDHA1, rGAPDH and formalin-killed S. iniae significantly induced the proliferation of sIg+ lymphocytes, the production of total serum IgM and specific IgM as compared with the control group, and rGAPDH and rPDHA1 provide higher RPS (62.5% and 75%, respectively) again. These results demonstrated that rPDHA1 and rGAPDH are promising vaccine candidates against S. iniae infection in flounder.