クニッツ型セリンプロテアーゼ阻害剤はヒラメの抗菌・抗炎症反応に新規に関与している

Kunitz-type serine protease inhibitor is a novel participator in anti-bacterial and anti-inflammatory responses in Japanese flounder (Paralichthys olivaceus).

• Xin Xu
• Jinxiang Liu
• Yujue Wang
• Yu Si
• Xuangang Wang
• Zhigang Wang
• Quanqi Zhang
• Haiyang Yu
• Xubo Wang

抄録

クニッツ型セリンプロテアーゼ阻害剤（KSPI）は、生体内のカスケード反応を制御するためにセリンプロテアーゼ（SP）と相互作用し、自然免疫において重要な役割を果たしている。理論的には、KSPIの様々な機能が支持されているが、これらの機能を完全に解明するためには、さらなる研究が必要である。本研究では、日本産ヒラメ（Paralichthys olivaceus）からKSPI分子を同定し、Pokspiと命名した。Pokspiの完全長cDNA配列は2810ntで、オープンリーディングフレーム1527ntを含み、509アミノ酸残基のポリペプチドをコードしていた。このタンパク質は、5つの会話ドメイン、すなわちMANEC, PKD, LDLaと2つのクニッツドメインを含んでいた。相同性解析の結果、PokspiはCynoglossus semilaevisの同族体と最も高い類似度（83％）を有していた。系統解析の結果、Pokspiは他の魚類の同族体とよく似ていることが明らかになった。その結果、PokspiのmRNA転写産物はすべての組織で検出され、最も発現量が多かったのは鰓、次いで腎臓、腸であった。その発現量は、エドワードシエラターダ（Edwardsiella tarda）の適用に応答して上昇し（in vivo）、病原体に関連する分子パターン（in vitro）は、様々な病原体に対する本質的な免疫防御にPokspiが関与していることを示唆している。大腸菌から精製した組換え型PoKspi（rPoKspi）は、セリンプロテアーゼ阻害活性だけでなく、宿主因子に依存しない幅広い抗微生物効果を示した。また、Pokspiは炎症性因子TNF-αおよびIL-1βのダウンレギュレーションを引き起こす可能性があることが明らかになった。結論として、Pokspiは抗菌・抗炎症作用を有する生理活性型セリンプロテアーゼ阻害剤である。本研究は、ヒラメの自然免疫防御を理解するための有力な証拠を提供するものである。

Kunitz-type serine protease inhibitor (KSPI) interacts with serine protease (SP) to regulate cascade reactions in vivo and plays essential roles in innate immunity. Theoretical considerations support various functions of kspi, but further studies are required for full characterization of these functions. In this study, a KSPI molecule was identified from Japanese flounder (Paralichthys olivaceus), and was named Pokspi. The full-length cDNA sequence of Pokspi was 2810 nt, containing an open reading frame of 1527 nt, which encoded a polypeptide of 509 amino acid residues. PoKspi protein contained five conversed domains, namely, MANEC, PKD, LDLa and two Kunitz domains. Homology analysis revealed that Pokspi shared the highest similarity (83%) with its homolog in Cynoglossus semilaevis. Phylogenetic analysis indicated that Pokspi clustered with the homologs in other fishes. The mRNA transcripts of Pokspi were detected in all tested tissues, with the highest expression level in gill, followed by kidney and intestine. Its elevated expression in response to the application of Edwardsiella tarda (in vivo) and pathogen-associated molecular pattern (in vitro) suggested the involvement of Pokspi in the essential immune defense against various pathogens. Recombinant PoKspi (rPoKspi) purified from Escherichia coli exhibited not only serine protease inhibitor activities but also a broad spectrum of anti-microbial effect in a manner that was independent of any host factors. In addition, the recombinant PoKspi protein could cause the down-regulation of pro-inflammatory factors TNF-α and IL-1β. In conclusion, Pokspi is a biologically active serine protease inhibitor endowed with anti-bacterial and anti-inflammatory property. This study provides strong evidences for understanding the innate immune defense in Japanese flounder.

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