238番目のアスパラギン酸をアルギニンに置き換えると、ピロリシンのオリゴマー化活性と炎症誘発性が低下します

Replacing the 238th aspartic acid with an arginine impaired the oligomerization activity and inflammation-inducing property of pyolysin.

• Wenlong Zhang
• Haili Wang
• Bing Wang
• Yue Zhang
• Yunhao Hu
• Bo Ma
• Junwei Wang

抄録

Trueperella pyogenes（T. pyogenes）は重要な日和見病原体である．ピロリシン（PLO）はT. pyogenesの病原性に重要な役割を果たしている。しかし、PLOの構造や機能と病原性との関係はよくわかっていない。本研究では、組換えPLOと3種類のPLO変異体を作製し、238番目のアスパラギン酸をアルギニンに置換したPLO D238Rは、コレステロール含有リポソーム上でのオリゴマー化活性とヒツジ赤血球膜上でのポア形成活性に障害を示した。さらに、調製した変異体を用いた研究により、PLO のポア形成活性は、IL-1β, TNF-α, IL-6 の発現レベルを上昇させ、マウスの過剰な炎症反応を誘導するために必須であることが確認された。対照的に、細胞膜結合能に障害のある別の変異体であるrPLO P499Fは、マクロファージおよびマウスにおけるIL-10の発現を有意に上昇させたのに対し、rPLOは上昇させなかったことから、病原体関連分子パターン（PAMP）活性に依存した炎症反応を誘発した。この結果は、PLO分子のドメイン1がポア形成活性の維持に重要な役割を果たしていることを示唆している。さらに、PLO の炎症誘発効果は、PAMP 活性ではなく、PLO ポア形成活性に起因していることが明らかになった。本研究の結果は、PLOの構造、機能、病原性に関する研究分野に新たな情報を提供するものであった。

Trueperella pyogenes (T. pyogenes) is an important opportunistic pathogen. Pyolysin (PLO) importantly contributes to the pathogenicity of T. pyogenes. However, the relationship between the structure and function and the virulence of PLO is not well documented. In the current study, recombinant PLO (rPLO) and three rPLO mutants were prepared. rPLO D238R, a mutant with the 238th aspartic acid replaced with an arginine, showed impairment in oligomerization activity on cholesterol-containing liposome and pore-forming activity on sheep red blood cell membrane. Further study employing the prepared mutants confirmed that the pore-forming activity of PLO is essential for inducing excessive inflammation responses in mice by upregulating the expression levels of IL-1β, TNF-α, and IL-6. By contrast, rPLO P499F, another mutant with impaired cell membrane binding capacity, elicited an inflammation response that was dependent on pathogen-associated molecular pattern (PAMP) activity, given that the mutant significantly upregulated the expression of IL-10 in macrophages and in mice, whereas rPLO did not. Results indicated that domain 1 of the PLO molecule plays an important role in maintaining pore-forming activity. Moreover, the PLO pore-forming activity and not PAMP activity is responsible for the inflammation-inducing effect of PLO. The results of this study provided new information for research field on the structure, function, and virulence of PLO.

ABBREVIATIONS:

T. pyogenes.Trueperella pyogenes; PLO: Pyolysin; rPLO: 組換えPLO; PAMP: 病原体関連分子パターン; CDCs: コレステロール依存性サイトリシン; PLY: ニューモライシン; NLRP3: NLRファミリーピリンドメイン含有タンパク質3; PRRs: パターン認識受容体; Asp: アスパラギン酸; TLR4: Toll様受容体4; Arg: アルギニン; Asn: アスパラギン; IPTG.イソプロピル-β-d-チオガラクトシド；ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水；ｓＲＢＣｓ：羊赤血球；ＴＥＭ：透過電子顕微鏡；ＲＢＣＭ：赤血球膜；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＮＣ膜：ニトロセルロース膜；ＳＤＳ-ＡＧＥ：ドデシル硫酸アガロースゲル電気泳動；ＭＤＢＫ細胞。マディンダービーウシ腎臓細胞；RPMI-1640培地。Roswell Park Memorial Institut-1640培地；FBS：ウシ胎児血清；BMDMs：骨髄由来マクロファージ；TNF-α：腫瘍壊死因子α；IL-1β．インターロイキン-１β；ＩＦＮ-γ：インターフェロン-γ；ＴＧＦ-β：トランスフォーミング増殖因子-β；ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着法。

ABBREVIATIONS: T. pyogenes: Trueperella pyogenes; PLO: Pyolysin; rPLO: recombinant PLO; PAMP: pathogen-associated molecular pattern; CDCs: cholesterol-dependent cytolysins; PLY: pneumolysin; NLRP3: NLR family pyrin domain containing protein 3; PRRs: pattern recognition receptors; Asp: aspartic acid; TLR4: Toll-like receptor 4; Arg: arginine; Asn: asparagine; IPTG: Isopropyl-β-d-thiogalactoside; PBS: phosphate-buffered saline; sRBCs: sheep red blood cells; TEM: Transmission electron microscopy; RBCM: red blood cell membrane; SDS-PAGE: sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis; NC membrane: nitrocellulose membrane; SDS-AGE: dodecyl sulfate agarose gel electrophoresis; MDBK cells: Madin-Darby bovine kidney cells; RPMI-1640 medium: Roswell Park Memorial Institute-1640 medium; FBS: fetal bovine serum; BMDMs: bone marrow-derived macrophages; TNF-α: tumor necrosis factor α; IL-1β: interleukin-1β; IFN-γ: interferon-γ; TGF-β: transforming growth factor-β; ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay.