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免疫蛍光イメージングによる高スループットRSVプラークアッセイの開発と応用
Development and application of a higher throughput RSV plaque assay by immunofluorescent imaging.
PMID: 30381239 DOI: 10.1016/j.jviromet.2018.10.022.
抄録
ウイルスプラークアッセイは、前臨床研究と臨床研究の両方において、新しい抗ウイルス薬やワクチンの開発と評価において重要なツールである。プラークアッセイは感染性ウイルスを測定するための標準的なツールですが、その方法は時間がかかり、プラークを認識するための経験を必要とします。また、プラークの認識や手作業でのカウントエラーにより、分析者間でのばらつきが生じやすい。ここでは、９６ウェルプレート形式を用いたＲＳＶウイルス力価および抗ＲＳＶ抗体中和力価を測定するための２つの簡易プラークアッセイの開発について述べる。まず、我々は、感染性RSVを測定するための定量的なプラークアッセイを構築するために、複数のパラメータを評価した。次に、従来のプラークアッセイからの根本的な変化を評価するために、アッセイ条件を最適化し、宿主細胞の一晩前播種を排除し、細胞のウイルス感染後に遠心分離ステップを追加しました。我々は、このアッセイをより強固なものにするために、宿主細胞密度、宿主細胞体積、ウイルス接種量、宿主細胞およびウイルス混合物のインキュベーション時間のための1つの実験内の4つの重要なパラメータを洗練させるためにDoEを設計しました。我々はまた、これらの条件を2つ目のアッセイに適応させましたが、これは抗RSV抗体の中和力価を決定するための自動プラーク還元中和アッセイ（PRNT）でした。両方のアッセイは、ウイルスプラークを検出するために免疫蛍光染色を利用する。免疫染色されたウェルの画像は、PerkinElmer EnSight装置によってキャプチャされ、3日目に収穫されたプラークの明確な視覚化を示しています。ソフトウェアアルゴリズムは、これらの蛍光"オブジェクト"の自動カウントのために特別に設計されました。定量的プラークアッセイは、従来のプラークアッセイで得られたものと同様のRSVの力価を提供した。この方法は、ウイルス排出効率試験において複数のワクチン候補をスクリーニングするために利用されています。自動化されたPRNTアッセイでは、公表されているデータと一致する抗体中和力価が得られました。この自動化された96ウェルプラークアッセイは、RSVサンプルをより高いスループットでスクリーニングすることを可能にし、ワクチンや薬剤評価のためにプラークを形成する他の感染性生物にも拡張することができます。
Viral plaque assays are important tools in the development and evaluation of new antiviral drugs or vaccines in both preclinical and clinical research. While plaque assays are the standard tools to measure infectious virus, the methodology is time-consuming and requires experience in recognizing plaques. The assays are also prone to variation among analysts due to plaque recognition and manual counting errors. Here we describe the development of two simplified plaque assays for measuring RSV virus titers and anti-RSV antibody neutralization titers using 96 well plate formats. First, we evaluated multiple parameters to build up a quantitative plaque assay to measure infectious RSV. We then optimized the assay conditions to assess the fundamental changes from the traditional plaque assay, which were elimination of overnight pre-seeding host cells and addition of a centrifugation step after viral infection of the cells. We designed DoE to refine four key parameters within one experiment for host cell density, host cell volume, viral inoculum volume, host cell and viral mixture incubation time to make this assay more robust. We have also adapted these conditions into a second assay, which was an automated plaque reduction neutralization assay (PRNT) to determine neutralization titers of anti-RSV antibodies. Both assays utilize immune fluorescence staining to detect viral plaques. The images of the immuno-stained wells are captured by the PerkinElmer EnSight instrument and show clear visualization of plaques harvesting on day 3. Software algorithm was specifically designed for automatic counting of these fluorescent "objects". The quantitative plaque assay provided titers of RSV similar to those obtained from the traditional plaque assay. The method has been successfully utilized to screen multiple vaccine candidates in viral shedding efficacy studies. The automated PRNT assay provided antibody neutralizing titers that matched with published data. This automated 96 well plaque assay has made it possible to screen RSV samples in a higher throughput manner, and can be extended to other infectious organisms that form plaques for vaccine or drug evaluation.
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