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勾配パターンチップを用いたヒト多能性幹細胞からの膵島様クラスター形成のナノ地形的制御
Nanotopographical regulation of pancreatic islet-like cluster formation from human pluripotent stem cells using a gradient-pattern chip.
PMID: 30529081 DOI: 10.1016/j.actbio.2018.12.011.
抄録
幹細胞の運命を制御するためのバイオエンジニアリングのアプローチは、生体内の微小環境を再現することを目的としている。近年、幹細胞のニッチのミクロ・ナノスケールのトポグラフィを操作して、外部からの機械的なキューを制御してin vitroでの幹細胞の運命と挙動を制御することが注目されています。ここでは、大きさや形状の異なるナノスケールのポリスチレン表面構造のグラジエントパターンチップを試験することにより、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）から膵臓細胞の3次元（3D）分化を改善するための最適なナノトポグラフィシステムを確立した。膵島の発生と成熟に必要な発生調節因子の発現を評価することにより、膵臓細胞の三次元分化に最適な条件を特定した。我々の結果は、孔部２（Ｐｏ-２、直径２００〜３００ｎｍ）パターンの勾配チップが、柱状パターンおよび平坦面の範囲にわたって試験した他の孔部直径（Ｐｏ-１、１００〜２００またはＰｏ-３、３００〜４００ｎｍ）のものと比較して、膵臓内分泌前駆細胞（ＰＤＸ１＋およびＮＧＮ３＋）のクラスターを生成するために最も効率的な設定であることを示した。さらに、Ｐｏ-２勾配パターン由来のクラスターは、島状の３次元スフェロイドを生成し、亜鉛キレート色素ジチゾンに対して陽性であることが確認された。このスフェロイドは、30%以上のCD200+内分泌細胞で構成され、NKX6.1とNKX2.2も発現していた。また、膵臓分化の最終段階では、インスリンを発現する膵β-細胞、インスリンとグルカゴンの両方を発現するポリホルモナル細胞が得られた。結論として、我々のデータは、hPSCsから特定の細胞型に分化するための最適な地形構造を、大きさと表面を変化させて設計されたグラジエントパターンチップを用いて効率的に試験できることを示唆している。意義の表明：本研究は、膵島様クラスターの分化のためにグラジェント・ナノパターン・チップを使用することを実証した。勾配ナノパターンチップは、3種類のナノサイズ（100-200nm、200-300nm、300-400nm）の異なる2種類の形状（ナノピラーとナノポア）で構成されている。その結果、膵島様クラスターの分化に最適なナノ構造は200～300nmのナノ細孔であることが分かりました。幹細胞由来のβ様細胞を用いた1型糖尿病（DM）の主要な治療選択肢の一つに細胞移植があります。我々は、細胞移植に最適なサイズとなる50μmの膵島様クラスターを作製しました。将来的には、この小さなクラスターは、細胞治療のための強力なソースを提供します。我々の知見は、勾配ナノパターン化チップは、細胞治療開発における潜在的な用途のための高純度の特定の機能性細胞型を生成するための強力なツールを提供することを示唆している。
Bioengineering approaches to regulate stem cell fates aim to recapitulate the in vivo microenvironment. In recent years, manipulating the micro- and nano-scale topography of the stem cell niche has gained considerable interest for the purposes of controlling extrinsic mechanical cues to regulate stem cell fate and behavior in vitro. Here, we established an optimal nanotopographical system to improve 3-dimensional (3D) differentiation of pancreatic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) by testing gradient-pattern chips of nano-scale polystyrene surface structures with varying sizes and shapes. The optimal conditions for 3D differentiation of pancreatic cells were identified by assessing the expression of developmental regulators that are required for pancreatic islet development and maturation. Our results showed that the gradient chip of pore-part 2 (Po-2, 200-300 nm diameter) pattern was the most efficient setting to generate clusters of pancreatic endocrine progenitors (PDX1+ and NGN3+) compared to those of other pore diameters (Po-1, 100-200 or Po-3, 300-400 nm) tested across a range of pillar patterns and flat surfaces. Furthermore, the Po-2 gradient pattern-derived clusters generated islet-like 3D spheroids and tested positive for the zinc-chelating dye dithizone. The spheroids consisted of more than 30% CD200 + endocrine cells and also expressed NKX6.1 and NKX2.2. In addition, pancreatic β- cells expressing insulin and polyhormonal cells expressing both insulin and glucagon were obtained at the final stage of pancreatic differentiation. In conclusion, our data suggest that an optimal topographical structure for differentiation to specific cell types from hPSCs can be tested efficiently by using gradient-pattern chips designed with varying sizes and surfaces. STATEMENT OF SIGNIFICANCE: Our study provides demonstrates of using gradient nanopatterned chips for differentiation of pancreatic islet-like clusters. Gradient nanopatterned chips are consisted of two different shapes (nanopillar and nanopore) in three different ranges of nano sizes (100-200, 200-300, 300-400 nm). We found that optimal nanostructures for differentiation of pancreatic islet-like clusters were 200-300 nm nano pores. Cell transplantation is one of the major therapeutic option for type 1 diabetes mellitus (DM) using stem cell-derived β-like cells. We generated 50 um pancreatic islet-like clusters in size, which would be an optimal size for cell transplantation. Futuremore, the small clusters provide a powerful source for cell therapy. Our findings suggest gradient nanopatterned chip provides a powerful tool to generate specific functional cell types of a high purity for potential uses in cell therapy development.
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