モンテネグロにおける桃のリンゴ葉斑病ウイルス、サクラ緑環斑病ウイルス、サクラ壊死性さび病斑病ウイルスの第一報

First Report of Apple chlorotic leaf spot virus, Cherry green ring mottle virus, and Cherry necrotic rusty mottle virus on Peach in Montenegro.

• J Zindović
• M Dall'Ara
• C Rubies Autonell
• C Ratti

抄録

2011年9月と2012年10月にモンテネグロの中央部と沿岸部で行われた調査で、桃の果樹の衛生状態を評価した。葉のサンプルは、葉色の輪や斑点、モザイク、壊死、葉の歪み、発育阻害を示す58本（2011年）と47本（2012年）の樹木から採取した。RNeasy Plant Mini kit（Qiagen社、ドイツ）を用いて各サンプルからTotal RNAを抽出し、PDO（polyvalent degenerate oligonucleotides）を鋳型として、トリコウイルス属、キャピロウイルス属、フォベウイルス属（Betaflexiviridae）に属する果樹ウイルスを検出するためのネステッド逆転写（RT）PCRに使用した。PDOプライマーセットPDO-F1i/PDO-R3i/PDO-R4iおよびPDO-F2i/PDO-R1i(2)をそれぞれ第1回RT-PCRおよびネステッドPCRに使用した。イタリアアップルクロロティックリーフスポットウイルス（ACLSV）感染単離株および健康な桃の葉から得られたTotal RNAを、それぞれ陽性対照および陰性対照として使用した。2011年に採取された6サンプル（10.3％）と2012年に採取された13サンプル（27.7％）からの362bp産物を、入れ子にしたプライマーセットで増幅した。配列解析には、異なる桃の品種（それぞれRitastar、Spring Belle、Redhaven）から選ばれた3つの分離株（367/11、133/12、168/12）が含まれていた。つの陽性サンプルからの部分ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの予想される大きさの増幅産物を、ｐ-ＧＥＭ-Ｔイージーベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にクローニングし、配列決定した（ＭＷＧ-Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ、ドイツ）。配列はGenBankに登録された。KF534757、KF534769、およびKF534766でそれぞれGenBankに登録された。BLAST解析の結果，分離株367/11（KF534757）の塩基配列はGenBankから分離されたACLSV株と高い類似度（78.9～87.2％）を示し，ドイツから分離されたPBM1（AJ243438）と最も高い同一性を示した。133/12株（KF534769）の配列解析では、世界各地から報告されているCGRMV（Cherry green ring mottle virus）と90.5～93.3％の同一性を示した。特にフランスから分離されたP1C124（AJ291761）と最も高いヌクレオチド類似性を示した。最後に，分離株168/12（KF534766）の塩基配列を解析したところ，チェリー壊死性さび病斑ウイルス（CNRMV）分離株の対応するヌクレオチド配列と高い同一性（86.1～96.1％）を示し，スイスの分離株120/86（AF237816）との類似性が最も高いことがわかった。ウイルスの感染性を確認するために、FAO/IPGRIテクニカルガイドライン(1)に基づき、367/11、133/12、168/12のサンプルの芽木を、モモ（GF305）、Prunus serrulata（シロフゲン）、P. avium（サム）の苗に接ぎ木し、管理された温室内で管理した。接種6ヶ月後、367/11サンプルを用いたGF305は、ACLSV感染に典型的な葉の緑色の窪んだ斑点に反応した。シロフゲンのサクラの木。シロフゲン（Shirofugen）ではエピナスティ、葉のねじれ、巻き込みなどのCGRMVに起因する症状が見られたが，サクラ（cv.Sam）では，CGRMVに起因する症状は見られなかった。Sam.168/12を接種したものでは，CNRMV感染により葉に典型的な壊死性のショットホールが発生した(1)。指標植物から得られたPCR産物を上記のようにRT-PCRで解析したところ、KF534757、KF534769、KF534766の配列と完全に同一性が認められ、既報のウイルス剤の存在が確認された。我々の知る限りでは、モンテネグロのモモにACLSV、CGRMV、CNRMVが発生した最初の報告である。この作物は経済的に重要な作物であるため、これらのウイルスの拡散を防ぐために、輸入植物の防除を改善し、ウイルステスト済みの伝播資材を使用するための衛生対策を講じる必要があります。参考文献(1) M. Diekmann and C. A. J. Putter.FAO/IPGRI 遺伝資源の安全な移動のための技術的ガイドライン。No.16.Stone Fruits, 1996.(2) X. Foissacら. Phytopathology 95:617, 2005.

The sanitary status of peach fruit trees was assessed in central and coastal regions of Montenegro during a survey in September and October of 2011 and 2012. Leaf samples were collected from 58 (2011) and 47 (2012) trees showing chlorotic rings and spots, mosaic, necrosis, leaf distortion, and stunting. Total RNAs was extracted from each sample by RNeasy Plant Mini kit (Qiagen, Germany) and used as a template in PDO (polyvalent degenerate oligonucleotides) nested reverse transcription (RT)-PCR for the detection of fruit tree viruses belonging to the genera Trichovirus, Capillovirus, and Foveavirus (family Betaflexiviridae). PDO primer sets PDO-F1i/PDO-R3i/PDO-R4i and PDO-F2i/PDO-R1i (2) were used in the first RT-PCR and nested PCR, respectively. Total RNAs obtained from Italian Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV)-infected isolate and healthy peach leaves were used as positive and negative controls, respectively. A nested set of primers amplified a 362-bp product from 6 samples collected in 2011 (10.3%) and 13 samples collected in 2012 (27.7%). Sequence analysis included three isolates (367/11, 133/12, and 168/12) chosen from different peach cultivars (Ritastar, Spring Belle, and Redhaven, respectively). Amplified products of expected size of the partial RNA-dependent RNA polymerase from three positive samples were cloned into p-GEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI) and sequenced (MWG-Biotech AG, Germany). Sequences were deposited in GenBank under accession nos. KF534757, KF534769, and KF534766, respectively. BLAST analysis showed that the sequence of isolate 367/11 (KF534757) shared high nucleotide similarity (78.9 to 87.2%) with ACLSV isolates from GenBank, showing highest identity with isolate PBM1 (AJ243438) from Germany. Sequence analysis of isolate 133/12 (KF534769) proved that it is 90.5 to 93.3% identical to Cherry green ring mottle virus (CGRMV) isolates reported from other parts of the world. In particular, the highest nucleotide similarity was showed with isolate P1C124 (AJ291761) from France. Finally, analysis of sequence from the isolate 168/12 (KF534766) revealed high degree of identity (86.1 to 96.1%) with the corresponding nucleotide sequences of the Cherry necrotic rusty mottle virus (CNRMV) isolates, showing highest similarity with isolate 120/86 (AF237816) from Switzerland. To confirm virus infectivity, according to the FAO/IPGRI Technical Guidelines (1), budwood from 367/11, 133/12, and 168/12 samples were grafted into seedlings of peach (GF305), Prunus serrulata (cv. Shirofugen) and P. avium (cv. Sam) then maintained in a greenhouse with controlled conditions. Six months post inoculation, GF305 indexed with 367/11 sample reacts with a green depressed mottle on leaves typical of ACLSV infection. Cherry tree of cv. Shirofugen indexed with sample 133/12 showed symptoms attributable to CGRMV such as epinasty, twisting and curling of leaves while a tree of cv. Sam indexed with 168/12 sample exhibited classical necrotic shot holes in leaves induced by CNRMV infection (1). Sequence analysis of PCR products obtained from indicator plants by RT-PCR as described above showed full nucleotide identity with KF534757, KF534769, and KF534766 sequences and confirmed the presence of previous described viral agents. To our knowledge, this is the first report of ACLSV, CGRMV, and CNRMV occurrence on peach in Montenegro. Due to the economic importance of this crop, sanitation measures should be adopted to improve the control of imported plants and the use of virus-tested propagation material in order to prevent spreading of these viruses. References: (1) M. Diekmann and C. A. J. Putter. FAO/IPGRI Technical Guidelines for the Safe Movement of Germplasm. No. 16. Stone Fruits, 1996. (2) X. Foissac et al. Phytopathology 95:617, 2005.