ヒトPrimPol DxEモチーフの不変グルタミン酸は、Mn依存性の特徴的な活性に重要な役割を果たしている

The invariant glutamate of human PrimPol DxE motif is critical for its Mn-dependent distinctive activities.

• Patricia A Calvo
• Guillermo Sastre-Moreno
• Cristina Perpiñá
• Susana Guerra
• María I Martínez-Jiménez
• Luis Blanco

抄録

PrimPolは、核内およびミトコンドリアのDNA複製中に失速したフォークの下流へのリプライマーゼに特化したヒトのプライマーゼ/ポリメラーゼです。ほとんどのプライマーゼやポリメラーゼと同様に、PrimPolは、触媒のための補因子として使用されるMgやMnのような2価の金属陽イオンを必要とします。しかし、PrimPolが介在する反応の間に最も生理的なシナリオであるであろう、これらの2つの金属補体を組み合わせて使用することの結果、および金属リガンドとして作用する潜在的なカルボキシレート残基（Asp、GluおよびAsp）の個々の寄与については、ほとんど知られていない。その結果、これら3つのカルボキシル酸の触媒的な関連性を確認し、GluがMnに大きく依存するPrimPol反応のエンハンサーであることを明らかにした。ここでは、Mg と Mn の両方のイオンが存在する場合に、PrimPol の Glu が 8oxodG のエラー耐性により顕著に寄与していることを明らかにした。さらに、Gluはプライマー/テンプレートの再配置を介したTLSイベントに重要であり、最適なプリマーゼ活性を達成するために重要であることが明らかになった。PrimPol:ssDNA:dNTPプレターナリー複合体のEMSA解析は、各金属リガンドの重要な役割を示し、Gluをより従来のアスパラギン酸塩に変更したときに有意な障害を示した。これらのデータは、PrimPol活性部位が、最適な入力ヌクレオチド安定化を達成するために、特にプライマー合成時に必要とされる、Mnイオンの使用を有利にするために、特定のモチーフA（DxE）を必要とすることを示唆している。

PrimPol is a human primase/polymerase specialized in downstream repriming of stalled forks during both nuclear and mitochondrial DNA replication. Like most primases and polymerases, PrimPol requires divalent metal cations, as Mg or Mn, used as cofactors for catalysis. However, little is known about the consequences of using these two metal cofactors in combination, which would be the most physiological scenario during PrimPol-mediated reactions, and the individual contribution of the putative carboxylate residues (Asp, Glu and Asp) acting as metal ligands. By site-directed mutagenesis in human PrimPol, we confirmed the catalytic relevance of these three carboxylates, and identified Glu as a relevant enhancer of distinctive PrimPol reactions, which are highly dependent on Mn. Herein, we evidenced that PrimPol Glu contributes to error-prone tolerance of 8oxodG more markedly when both Mg and Mn ions are present. Moreover, Glu was important for TLS events mediated by primer/template realignments, and crucial to achieving an optimal primase activity, processes in which Mn is largely preferred. EMSA analysis of PrimPol:ssDNA:dNTP pre-ternary complex indicated a critical role of each metal ligand, and a significant impairment when Glu was changed to a more conventional aspartate. These data suggest that PrimPol active site requires a specific motif A (DxE) to favor the use of Mn ions in order to achieve optimal incoming nucleotide stabilization, especially required during primer synthesis.

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